PCR反应每个步骤的温度和时间设定
2025-05-28 来源:本站 点击次数:638
PCR反应的温度和时间是确保反应高效和特异性的关键因素。以下是每个步骤的温度和时间设定：
1. 变性（Denaturation）
温度：9498°C
时间：12分钟（对于初次循环）；之后的循环通常为3060秒
目的：使双链DNA解旋，分离成单链。初次循环可能需要更长的时间以确保完全变性，尤其是在模板DNA复杂或GC含量高时。
2. 退火（Annealing）
温度：5565°C，具体取决于引物的Tm值
时间：2040秒
目的：引物与模板单链结合。最佳退火温度通常比引物Tm值低25°C，以避免非特异性结合。
3. 延伸（Extension）
温度：72°C（对于Taq酶）
时间：根据扩增片段长度，通常每1000个碱基需要1分钟，但现代聚合酶可能更快。例如，1000bp片段可能需要1分钟。
目的：DNA聚合酶在这一阶段合成新的互补链。
4. 终延伸（Final Extension）
温度：7074°C
时间：515分钟
目的：确保所有片段都完全延伸。
5. 冷却（Cooling）
温度：415°C
时间：无限期（用于短期保存产物）
目的：停止反应，防止进一步的DNA合成。
总结：
1. 变性（Denaturation）
温度：9498°C
时间：12分钟（对于初次循环）；之后的循环通常为3060秒
目的：使双链DNA解旋，分离成单链。初次循环可能需要更长的时间以确保完全变性，尤其是在模板DNA复杂或GC含量高时。
2. 退火（Annealing）
温度：5565°C，具体取决于引物的Tm值
时间：2040秒
目的：引物与模板单链结合。最佳退火温度通常比引物Tm值低25°C，以避免非特异性结合。
3. 延伸（Extension）
温度：72°C（对于Taq酶）
时间：根据扩增片段长度，通常每1000个碱基需要1分钟，但现代聚合酶可能更快。例如，1000bp片段可能需要1分钟。
目的：DNA聚合酶在这一阶段合成新的互补链。
4. 终延伸（Final Extension）
温度：7074°C
时间：515分钟
目的：确保所有片段都完全延伸。
5. 冷却（Cooling）
温度：415°C
时间：无限期（用于短期保存产物）
目的：停止反应，防止进一步的DNA合成。
总结：
- 变性时间较长（初次循环），后续循环较短，确保DNA充分变性而不影响酶活性。
- 退火时间固定，保证引物正确结合。
- 延伸时间根据片段长度调整，确保完整复制。
- 终延伸确保所有片段完全合成。
- 冷却步骤用于终止反应和保存产物。
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