细胞的冻存和复苏详细的步骤和注意事项
2025-06-05 来源:本站 点击次数:35
细胞的冻存和复苏是细胞培养过程中的两个关键步骤，用于长期保存细胞并使其能够在需要时恢复活性。
以下是详细的步骤和注意事项：
细胞冻存步骤：
1. 准备冻存液：通常使用90%血清+10%DMSO（或购买专用的细胞冻存液）作为冻存液。DMSO是一种常用的冷冻保护剂，能减少冰晶形成对细胞的损伤。
2. 收集细胞：先将细胞离心收集，去除旧培养基。
3. 计数细胞：根据需要，可以计数细胞以确保合适的密度。
4. 重悬细胞：将细胞与冻存液按适当比例混合，调整至合适的细胞密度（如3×10^6~1×10^7 cells/mL）。
5. 分装冻存管：将细胞悬液分装至冻存管中，通常每管1~1.5毫升。
6. 程序降温：将冻存管按照程序降温原则处理，可以使用程序降温盒（异丙醇需要高于最低刻度线）或直接放入80℃冰箱过夜，然后转移到液氮中长期保存。非程序冻存时，可直接从室温快速降至80℃冰箱，再转入液氮。
7. 保冷转移：在转移过程中，确保冻存管不会暴露于常温，可以使用干冰或少量液氮保护。
细胞复苏步骤：
1. 准备培养基：提前预热培养基至37℃。
2. 快速解冻：从液氮中取出冻存管，迅速浸入37℃水浴中，快速摇晃直至完全融化，时间控制在一分钟内。
3. 离心处理：将融化后的细胞悬液离心（如1200rpm, 3分钟），去除上清液。
4. 重悬细胞：用新鲜培养基重悬细胞，调整至适当的细胞密度。
5. 接种细胞：将细胞接种于预先准备好的培养瓶或培养皿中，加入适量的培养基。
6. 培养观察：细胞接种后，放入培养箱中培养，贴壁细胞通常在24小时内观察贴壁情况，悬浮细胞则在3天内不建议离心换液。
注意事项：
1、细胞存活率检测：冻存后应复苏一管细胞检测存活率。
2、程序降温盒维护：使用程序降温盒时，异丙醇需定期更换，且降温盒需恢复室温后使用。
3、避免温度波动：冻存和复苏过程中避免细胞暴露于温度波动，尤其是快速降温盒的使用。
4、无菌操作：所有操作应在无菌环境下进行，使用75%酒精消毒工作台和冻存管表面。
5、细胞密度：冻存时保持适宜的细胞密度，复苏时根据细胞类型决定是否离心去除DMSO。
6、安全防护：操作液氮时需戴防冻手套和护目镜，避免冻存管爆炸。
通过遵循这些步骤和注意事项，可以有效保存和恢复细胞的活性，确保实验的连续性和数据的可靠性。
以下是详细的步骤和注意事项：
细胞冻存步骤：
1. 准备冻存液：通常使用90%血清+10%DMSO（或购买专用的细胞冻存液）作为冻存液。DMSO是一种常用的冷冻保护剂，能减少冰晶形成对细胞的损伤。
2. 收集细胞：先将细胞离心收集，去除旧培养基。
3. 计数细胞：根据需要，可以计数细胞以确保合适的密度。
4. 重悬细胞：将细胞与冻存液按适当比例混合，调整至合适的细胞密度（如3×10^6~1×10^7 cells/mL）。
5. 分装冻存管：将细胞悬液分装至冻存管中，通常每管1~1.5毫升。
6. 程序降温：将冻存管按照程序降温原则处理，可以使用程序降温盒（异丙醇需要高于最低刻度线）或直接放入80℃冰箱过夜，然后转移到液氮中长期保存。非程序冻存时，可直接从室温快速降至80℃冰箱，再转入液氮。
7. 保冷转移：在转移过程中，确保冻存管不会暴露于常温，可以使用干冰或少量液氮保护。
细胞复苏步骤：
1. 准备培养基：提前预热培养基至37℃。
2. 快速解冻：从液氮中取出冻存管，迅速浸入37℃水浴中，快速摇晃直至完全融化，时间控制在一分钟内。
3. 离心处理：将融化后的细胞悬液离心（如1200rpm, 3分钟），去除上清液。
4. 重悬细胞：用新鲜培养基重悬细胞，调整至适当的细胞密度。
5. 接种细胞：将细胞接种于预先准备好的培养瓶或培养皿中，加入适量的培养基。
6. 培养观察：细胞接种后，放入培养箱中培养，贴壁细胞通常在24小时内观察贴壁情况，悬浮细胞则在3天内不建议离心换液。
注意事项：
1、细胞存活率检测：冻存后应复苏一管细胞检测存活率。
2、程序降温盒维护：使用程序降温盒时，异丙醇需定期更换，且降温盒需恢复室温后使用。
3、避免温度波动：冻存和复苏过程中避免细胞暴露于温度波动，尤其是快速降温盒的使用。
4、无菌操作：所有操作应在无菌环境下进行，使用75%酒精消毒工作台和冻存管表面。
5、细胞密度：冻存时保持适宜的细胞密度，复苏时根据细胞类型决定是否离心去除DMSO。
6、安全防护：操作液氮时需戴防冻手套和护目镜，避免冻存管爆炸。
通过遵循这些步骤和注意事项，可以有效保存和恢复细胞的活性，确保实验的连续性和数据的可靠性。
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