方案摘要：本方案依托 RAYPA 培养基自动制备分装仪的自动制备、灭菌、精准分装的优势，及 Pipetty 电动移液器精度高、可连续分液、重复性强的特点，在符合检测标准的基础上，简化操作步骤、减少人为误差，提升检测效率与结果稳定性。
 
方案详情：
一、实验原理
       基于大肠菌群生化特性（发酵乳糖产气）筛选与统计学概率估算结合。大肠菌群为革兰氏阴性菌，初发酵用 LST 肉汤抑制革兰氏阳性菌，其发酵乳糖产气者判为疑似阳性；复发酵用 BGLB 肉汤排除假阳性，确保特异性。样品经 10 倍递增稀释后，选 3 个连续稀释度各接种 3 管，通过阳性管数反映菌量分布。基于泊松分布原理，对照 MPN 检索表得出 “最可能数”，解决菌群分布不均的计数难题，实现定量估算。
 
二、‌实验准备
1、设配和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下：
① RAYPA培养基自动制备分装仪;
② Pipetty 电动移液器MSIC01-03-1000;
③ 恒温培养箱:36 ℃±1 ℃、30 ℃±1℃;
④ 冰箱:2 ℃~8 ℃;
⑤ 恒温装置:48 ℃±2 ℃;
⑥ 天平:感量 0.1 g;
⑦ 均质器及无菌均质袋、均质杯,振荡器;
⑧ 试管:15 mm×150 mm、18 mm×180 mm；
⑨ 无菌锥形瓶:容量 500 mL;
⑩ 无菌培养皿:直径 90 mm;
⑪ pH 计或精密 pH 试纸;
⑫ 无菌接种环:10 μL(直径约3 mm);
⑬ 自动菌落计数仪。

2、试剂和材料
① 磷酸盐缓冲液；
② 生理盐水；
③ 月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤；
④ 煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤；
⑤ 结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)；
⑥ 1 mol/L NaOH；
⑦ 1 mol/L HCl；
⑧ 大肠菌群计数测试片。
 
三、实验步骤
1、样品稀释
① 固体和半固体样品:无菌操作称取 25g样品,放入盛有 225 mL磷酸盐缓冲液的无菌均质杯内,8000 r/min~10000 r/min 均质1 min~2 min，制成 1:10 的样品匀液。
② 液体样品:用无菌吸管吸取 25 mL样品置于盛有 225 mL磷酸盐缓冲液的无菌锥形瓶(瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠)中充分混匀,制成1:10 的样品匀液。
③ 必要时用1 mol/l NaOH 或1 mol/L HC1,调节样品匀液或液体样品原液的pH至 6.5~7.5之间。
④ 用Pipetty电动移液器吸取1mL的1:10 样品匀液，沿管壁缓缓注入装有9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),将试管在振荡器上振荡混匀,制成1:100 的样品匀液。
 
⑤ 根据对样品污染状况的估计,参照上述稀释操作,依次制成 10倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次,换用1支无菌吸管或吸头。全程依托电动移液器的精准定量功能，避免手工吸液的误差。
2、初发酵试验
① 提前通过 RAYPA 培养基自动制备分装仪设置参数配制 LST 肉汤， 设定分装体积（单料 LST 肉汤每管 10mL，双料 LST 肉汤每管 20mL）；自动灭菌后，将培养基分装至无菌试管中，分装后试管自动冷却至室温备用。
 
② 根据样品污染状况估计，选择 3 个适宜连续稀释度（液体样品可含原液），每个稀释度对应 3 管 LST 肉汤。使用 Pipetty 电动移液器，无菌吸取各稀释度样品匀液 1mL，快速注入对应 LST 肉汤管中，吸头一次性使用，避免交叉污染。
③ 将接种后的 LST 肉汤管置于 36℃±1℃培养箱中，培养 24h±2h，观察小倒管或产气收集装置的气泡产生情况（轻轻振摇试管，若有细密气泡持续上升即为产气）。产气者直接进入复发酵试验；未产气者继续培养至 48h±2h，若产气则转入复发酵，仍未产气判定为大肠菌群阴性。若 48h±2h 内所有 LST 肉汤管均未产气，直接参照MPN 检索表，报告每克（毫升）样品的 MPN 值。
3、复发酵试验
① 通过 RAYPA 培养基自动制备分装仪配制 BGLB 肉汤，设定分装体积为 10mL / 管，启用 “灭菌 - 分装” 模式，灭菌后冷却备用，RAYPA 可保证每管 BGLB 肉汤浓度一致、无菌性达标。
 
② 轻轻振摇所有产气的 LST 肉汤管，用无菌接种环取 1 环培养物，精准转种至预置的 BGLB 肉汤管中，Pipetty 可辅助吸取少量培养物用于微量转种，提升操作便捷性。
③ 将 BGLB 肉汤管置于 36℃±1℃培养箱中，培养 24h±2h，观察产气情况：产气者判定为大肠菌群阳性；未产气者继续培养至 48h±2h，若产气仍为阳性，始终未产气则为阴性。
四、结果报告
根据复发酵试验中3个适宜连续稀释度中大肠菌群阳性的管数,按照 MPN 检索表,报告每克(毫升)样品中大肠菌群的MPN 值,以 MPN/g(mL)表示。