人胚胎肾（HEK）细胞，尤其是经过基因编辑的 HEK293 衍生物，是基因治疗和生物制品开发常用的细胞株。目前，越来越多的应用涉及 HEK 单克隆细胞库的建立，但是 HEK 单细胞的生长仍然是一个持续存在的瓶颈。在单细胞分选后，细胞的恢复率通常较低，且克隆形成不稳定，这导致项目周期延长、耗材及试剂用量增加。而传统的补充剂或条件培养基往往存在变异性且制备过程繁琐的问题。故优化 HEK 单克隆培养体系是非常关键的。

NewBiologix 是一家专注于基因治疗应用的工程化 HEK293 细胞株平台（Xcell™ Eng-HEK293）的生物技术公司，该公司致力于 HEK293 细胞株培养体系的优化。本文介绍了 NewBiologix 使用 InstiGRO HEK 优化 HEK 293 单细胞培养体系的经验，并将其与另一种常用的补充剂（Suppl. Mix A）进行了对比，实验表明 InstiGRO 能够显著促进 HEK293 单细胞活率，提高筛选效率。

材料与方法 

细胞株：NewBiologix 在所有实验中使用了经过工程改造的 HEK293 细胞株，即 Xcell™ Eng-HEK293。细胞在 384 孔板中进行铺板，使用的是细胞分选仪 1（用于实验 1 和实验 2）和细胞分选仪 2（仅用于实验 2）。
培养基条件：两个平行实验分别使用两种培养基，即称为培养基 1 和培养基 2。
预处理条件：对于实验 1，一组细胞在分离前用 InstiGRO HEK（1/20）培养 22 小时。另一组细胞则未进行处理。
克隆恢复率定义：HEK 细胞在分离后经过 10 天的培养，选取直径≥ 150 微米的克隆团定义为一个有效的克隆团。克隆恢复率计算公式为：（直径≥ 150 微米的克隆团孔数/铺板单个细胞的总孔数）× 100。
补充剂测试条件：
Suppl. Mix A
Suppl. Mix A + 20% CM
InstiGRO^® HEK (1/20 稀释倍数)
InstiGRO^® HEK (1/20 稀释倍数) + 20% CM 

铺板版型：
实验 1：使用单细胞分选仪 1 铺 2 块 384 孔板
实验 2：使用单细胞分选仪 1铺 1 块 384 孔板；使用使用单细胞分选仪 2 铺 3 块 384 孔板。

结果

在实验 1 中，Xcell™ Eng-HEK293 细胞在分离前 22 小时用 InstiGRO HEK 处理或不处理。随后，分别在两种培养基类型下测试了四种补充剂条件。如图 1 所示，1/20 InstiGRO HEK + 20% CM 的组合在两种培养基和处理条件下均实现了最高的单克隆恢复率，尤其是在使用培养基 2 且未预先处理的细胞中，单克隆恢复率高达 64%。

图1. 不同补剂条件下的单克隆恢复率。条形图表示在 Day10 含有直径 ≥150 微米克隆团的孔的百分比（每种条件 n = 48 孔）。无论是否进行预处理，InstiGRO HEK 相比补剂混合物 A 都显著提高了克隆恢复率。

相比于补剂 Mix A,InstiGRO HEK 显著增加了克隆团直径。
为了评估克隆团的健康状况和稳定性，我们在单细胞分离后第 10 天通过成像分析测量了平均克隆直径。如图 2 所示，无论是否添加条件培养基（CM），相比于补剂 MixA，InstiGRO HEK 均能促进克隆团生长，克隆团直径更大。无论使用哪种培养基，添加 1/20 InstiGRO HEK 和 20% 条件培养基的条件下，无论是否经过预处理，观察到的平均克隆团直径最大。

图2. 实验 1 中不同补剂条件下平均克隆团直径（微米）。克隆团直径通过成像进行分析。图中数据为每种条件下 48 个孔的平均值。在两种测试培养基中，InstiGRO HEK 均显著提高了克隆团大小，与对照补剂相比效果尤为明显。

不同单细胞铺板仪使用 InstiGRO HEK 的单克隆恢复率保持一致。
在实验 2 中， 通过使用两种不同的细胞分选仪来评估 InstiGRO HEK 性能的可重复性。Xcell™ Eng-HEK293 细胞通过细胞分选仪 1 或细胞分选仪 2 被分离到 384 孔板中，并在含有补剂 Mix A + 20% 条件培养基（CM）与 1/20 InstiGRO HEK + 20% 条件培养基的条件下评估单克隆恢复率。

如图 3 所示，InstiGRO HEK 在两种细胞分选仪和培养基条件下均保持了较高的单克隆恢复率。补剂 mixA 的条件下单克隆恢复率最高可达 15% 到 26%，而 InstiGRO HEK 的条件下单克隆恢复率达到了 49% 到 52%，这证实了该补剂的稳定性，且不受分离方法的影响。

图3. 实验 2 中使用两种不同细胞分选仪的单克隆恢复率比较。条形图表示每种条件下含有直径 ≥150 微米的存活但克隆团的孔的平均百分比（每种条件 n = 128-384 孔）。在两种细胞分选仪中，InstiGRO HEK + 条件培养基（CM）的表现均优于补剂 Mix A + 条件培养基（CM）。

讨论与结论

NewBiologix 评估了不同补剂对 HEK293 工程株单克隆工作流程的促进作用。在两个独立实验中，无论是否添加条件培养基 CM，InstiGRO HEK 均展现出比补剂 mixA 更高的单细胞恢复率和更大的平均克隆团直径。这些改进在两种不同的基础培养基中均有体现，并且在两种测试的细胞分选仪中表现一致。

无需预处理且几乎不依赖条件培养基即可获得稳定结果，表明 InstiGRO HEK 为 HEK 细胞分离后的扩增提供了一种可重复、易适配的解决方案。这能显著降低繁琐工艺，尤其适用于早期开发阶段——此时扩增效率与一致性至关重要。
 

“InstiGRO HEK 帮助我们实现了稳定的高单细胞恢复率，并培养出体积大、状态健康的克隆团。我们可以快速且轻松地将 InstiGRO HEK 整合到单细胞分离工作流程中。”

——Melissa Vona

NewBiologix高级研发工程师

关于NewBiologix

NewBiologix SA 是一家专注于基因与细胞治疗生产的瑞士生物技术公司，致力于创新工程化解决方案与前沿技术。公司凭借在细胞系工程领域的深厚专长，结合对基因治疗生产痛点的精准洞察，推出了 Xcell™ 技术组合，一套可深度解析重组腺相关病毒（rAAV）质量的全流程技术平台。通过帮助合作伙伴更快、更安全、更大规模地生产高可靠性基因疗法，NewBiologix 正在重塑患者健康的未来。
了解更多信息请访问：www.newbiologix.com 

关于InstiGRO HEK

安达望（Advanced Instruments） 提供一系列化学成分明确、无动物源成分的细胞生长补剂，专为支持 HEK293 细胞而设计。InstiTHAW^®、InstiGRO^® 和 InstiSHAKE^® 三款细胞培养补剂经过精心研发，可全方位助力基因治疗开发，确保细胞生长与性能达到卓越水平。 

InstiTHAW HEK：在细胞冻存与复苏过程中提供全面保护，最大限度减少损伤。InstiGRO HEK：在单细胞分离后及稳定细胞株开发阶段为细胞提供关键营养，促进健康克隆团的形成。InstiSHAKE HEK：优化摇瓶培养条件，为重组病毒载体的规模化生产奠定基础。 

特别说明：  

InstiGRO HEK 专为单细胞培养设计，能持续支持单个细胞生长形成健壮的克隆团。其使用极为便捷——只需将补剂加入培养基，即可直接进行单细胞铺板，无需额外步骤。