Acute Shear Stress Induces TWIST-Mediated EndMT in Venous Endothelial Cells and Human Long Saphenous Veins

Keywords: CABG; Dexamethasone; EndMT; saphenous vein.

冠状动脉旁路移植术（CABG）是治疗严重冠状动脉疾病的有效方法，其中长隐静脉/大隐静脉（LSV）是最常用的导管。然而，LSV移植物的长期通畅率受到内膜增生（IH）发展的限制，这会导致移植物失败和不良心血管事件。IH是一个多因素影响的过程，当静脉植入动脉循环时，LSVs暴露于急性血流动力学可能在这一过程中发挥关键作用。

内皮间充质转化（EndMT）与静脉移植物插入动脉循环后重塑过程中的细胞表型适应调节有关，TGFβ/SMAD信号通路在这一过程中起着重要作用。研究已证明，静脉（而非动脉）内皮细胞（ECs）急性暴露于动脉剪切应力与不同促炎通路的激活（包括MAPK和NF-kB）有关，从而导致不同促炎分子（如VCAM和MCP-1）的上调。此外，动脉剪切而不是静脉剪切激活了静脉ECs中的这种反应。

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糖皮质激素可调节多种重要的心血管、代谢和免疫功能。zhong所周知，糖皮质激素可以显著抑制TGFβ的产生，并调节SMAD家族和EndMT各种成员的活性。已有研究评估了合成糖皮质激素（人造），如地塞米松（Dexamethasone），在调节血管炎症和静脉移植物IH中的作用。

基于此，英国莱斯特大学心血管科学系团队在最近的一项研究中旨在深入了解急性动脉血流动力学对体外 HUVECs 和离体 LSVs 中 EndMT 激活的影响，并探讨地塞米松（Dex）在 LSVs 中调节 EndMT 的作用。研究成果发表于 CELLS 期刊题为“Acute Shear Stress Induces TWIST-Mediated EndMT in Venous Endothelial Cells and Human Long Saphenous Veins”。

首先，研究了急性层流动脉剪切应力（LSS，0.5 或 12 dyn/cm2分别模拟静脉和动脉剪切应力）对体外 EndMT 激活的影响。结果观察到，使用平行板流动室将LSS应用于HUVECs 4小时激活炎症介质，如MCP-1和CXCL8的表达增加，还注意到血管内皮钙粘蛋白（VE-CADHERIN）的显著下调和波形蛋白（VIMENTIN）、TWIST1和TWIST2基因表达的上调（图1 A）。这些数据表明，ASS 可以触发 HUVECs 中的 EndMT。

为了检查TGFβ的作用，使用TGFβ的药理学抑制剂（SB505124），该抑制剂已知可抑制激活素A受体II型样激酶（ALK5）。结果观察到，用抑制剂预处理HUVECs（5μmol / L，60分钟）4小时后在转录物和蛋白质水平上均抑制了对上述表型变化的诱导。这种抑制与早期（45 分钟）抑制 ALK5 激活和 SMAD 2/3 磷酸化有关。因此，可得出结论，HUVECs 对 LSS 下 TGFβ 依赖性诱导的 EndMT 敏感。

此外，在剪切刺激的HUVECs中使用特异性siRNAs抑制信使RNA表达以评估TWIST转录因子TWIST1&2的作用。免疫染色（图1 E）和WB检测显示，沉默 TWIST1 或 TWIST2 抑制 EndMT 会在转录水平和蛋白质水平上改变 LSS 下 HUVECs的变化，但不影响上游 ALK5 对 SMAD 2/3 磷酸化的激活，表明TWIST1和TWIST2都可以在体外LSS刺激下的EndMT过程中发挥作用。尽管TWIST1和TWIST2没有相互调节彼此的表达，但正如在不同条件下所显示的那样，在急性动脉血流动力学下，两者都需要合作来激活反应。

图1     动脉剪切应力对静脉内皮细胞（Ecs）中促炎基因和 EndMT 基因的影响。

接下来，使用10μmol/L的Dex预处理60分钟，注意到HUVEC对LSS的反应发生了显著变化。Dex预处理导致在45分钟时抑制ALK5激活和SMAD2/3磷酸化（图2 A）。此外，它与 TWIST1、TWIST2 和 VIM 的抑制有关，同时免疫染色和 WB检测显示，其在转录本和蛋白质水平上恢复VE-钙粘蛋白的表达。这些结果表明，使用Dex可以通过靶向部分ALK5/SMAD/TWIST通路来抑制HUVECs中响应LSS的EndMT变化。

图2    地塞米松通过剪切应力抑制培养静脉内皮细胞（Ecs）中的EndMT激活。活。

进一步地，研究人员通过暴露于离体急性动脉流的新鲜采集的人隐静脉来验证上述体外发现。对暴露于急性动脉血流动力学4小时的静脉段进行了空间细胞RNA测序，鉴定出一组同时具有EC和SMC表型（EC/SMC）的细胞，表明它可能代表中间状态的EndMT。该簇中鉴定出16954个基因，其中，486 个在流动条件下受到显著差异调节，包括 TWIST2 。当特别关注该簇群中的 TWIST2 网络分析时，注意到与 TGIF1、FOXC2、CD44、CYP1B1、NFIC、REL 和 FOXC1 等基因的关联及其后续关联。这些基因参与炎症、EndMT、免疫信号传导、分化和细胞凋亡等过程。

最后，为了验证上述与 EndMT 相关基因的发现，建立了靶向方法，包括全组织的 RT-PCR 和 RNAscope，并研究了离体Dex 对静脉进行简短预处理的影响。除了抑制对急性动脉血流的促炎反应外，使用RT-PCR和RNAscope检测显示（图3 A），Dex预处理在4小时时在转录水平上抑制TWIST1和TWIST2的表达，这证明了ECs中两种RNA转录的激活和定位，这些转录被Dex处理抑制（图3 B）。此外，这种简短的预处理能够抑制 RNA 上VE-钙粘蛋白和 VIM 在 ECs 中的 EndMT 表型变化，还显著调节了TWIST1、TWIST2、VE-钙粘蛋白和VIM蛋白水平。免疫组织染色显示，Dex效果还与ALK5表达和SMAD 2/3激活（磷酸化）的快速（45分钟）显著降低有关（图3 E）。有趣的是，当使用 RNAscope 观察 SNAIL1 转录时，注意到 ECs 中没有激活，仅存在于 SMCs 中，这被 Dex 预处理抑制，表明 TWIST 和 SNAIL 转录因子可能对特定细胞类型起作用。

同时，考虑到长时间流动刺激实验的局限性，还比较了短暂Dex预处理后LSV培养10 天后的效果，发现短暂的单次处理足以在培养后10天抑制EndMT。当比较低流量对LSV ECs激活的作用时，发现低流量不会触发离体LSVs的任何EndMT变化。总 SMAD 水平也没有变化。因此，可得出结论，用Dex进行短暂的预处理（60分钟）可以通过抑制TGFβ / SMAD1通路来抑制LSV ECs中响应剪切应力的EndMT激活。

图3    用地塞米松预处理人长隐静脉可抑制内皮细胞（EC）中剪切应力对 EndMT 的激活。

图4   图形概要

综上所述，该研究结果表明，TGFβ-/SMAD-/TWIST1&2 介导的 EndMT 在体外暴露于急性动脉血流动力学时在静脉移植物内被激活，并且用地塞米松对静脉进行短暂预处理可以抑制其激活和相关的微钙化，这可能会调节静脉移植物内膜增生的发展。尽管这项研究中重点关注ALK5/SMAD通路，但有证据表明糖皮质激素可有效抑制BMP2等骨形态发生蛋白表达。因此，讨论 LSVs 中的 EndMT 以及 BMP 在未来研究中的作用将会很有趣。最重要的是，这项研究侧重于短期变化，未来将结合空间细胞测序和 RNASCope 等新技术在先前动物研究的基础上进行扩展，以研究地塞米松短期局部预处理对大型动物模型中 IH 形成的影响。

参考文献：Ladak SS, McQueen LW, Tomkova K, Layton GR, Murphy GJ, Zakkar M. Acute Shear Stress Induces TWIST-Mediated EndMT in Venous Endothelial Cells and Human Long Saphenous Veins. Cells. 2025 Sep 2;14(17):1369. doi: 10.3390/cells14171369. PMID: 40940783; PMCID: PMC12428368.
原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40940783/

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