方案摘要：本方案基于大肠菌群MPN计数法原理，融合Pipetty电动移液器与RAYPA培养基自动制备分装仪核心优势，优化检测全流程。RAYPA实现LST、BGLB肉汤的标准化制备、灭菌及定量分装，保证培养基成分均匀、体积精准，降低污染风险；Pipetty 凭借精准数字化控量、防残留设计，高效完成样品10倍递增系列稀释与接种，缩短操作耗时，确保全程符合15分钟时限要求。两款仪器协同，减少人为误差、强化无菌控制，适配批量检测需求，最终通过初发酵、复发酵筛选阳性管，对照MPN检索表，精准报告样品中大肠菌群含量（MPN/g/mL），兼顾检测准确性与标准化。
 
方案详情：
一、实验原理
       大肠菌群MPN计数法是结合统计学概率与微生物代谢特性的间接计数法。核心为：将样品10倍递增系列稀释，降低菌浓度至适宜计数范围；接种含乳糖的选择性培养基（如LST、BGLB肉汤），大肠菌群发酵乳糖产酸产气，据此判断阳性管；选3个连续稀释度，记录各稀释度阳性管数；该阳性管组合对应统计学“最可能数”，对照MPN检索表即可推算样品中大肠菌群的估算含量，兼具选择性与概率代表性。
 
二、‌实验准备
1、设配和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下：
① Pipetty 电动移液器；
② 冰箱:2 ℃~8 ℃；
③ 恒温装置:48 ℃±2℃；
④ 天平:感量 0.1 g；
⑤ 均质器及无菌均质袋、均质杯,振荡器；
⑥ 试管:15 mmX150 mm、18 mmX180 mm ；
⑦ 恒温培养箱:36 ℃±1 ℃、30 ℃±1℃；
⑧ 无菌锥形瓶:容量 500 mL；
⑨ 无菌培养皿:直径 90 mm；
⑩ pH 计或精密 pH 试纸；
⑪ 无菌接种环:10 μL(直径约3mm)；
⑫ 自动菌落计数仪。
 
2、试剂和材料
① 磷酸盐缓冲液；
② 生理盐水；
③ 月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤；
④ 煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤；
⑤ 结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)；
⑥ 1 mol/L NaOH；
⑦ 1 mol/L HCl；
⑧ 大肠菌群计数测试片。
三、实验步骤
1、稀释样品
① 固体和半固体样品:无菌操作称取 25g样品,放入盛有 225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内,8 000 r/min~10 000 r/min 均质1 min~2 min。
② 液体样品:用无菌吸管吸取 25 mL样品置于盛有 225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠)中充分混匀。
③ 必要时用1 mol/L, NaOH 或1 mol/L HC1,调节样品匀液或液体样品原液的 pH 至 6.5~7.5之间。
④ 使用Pipetty电动移液器，装配无菌吸头，吸取1:10样品匀液1mL，沿无菌试管管壁缓缓注入预装有9mL缓冲液/生理盐水的无菌试管中（吸头尖端不触及稀释液面）。试管置于振荡器上振荡混匀，制成 1:100 匀液；按样品污染状况估计，重复上述操作，依次制备10倍递增系列稀释液，每递增稀释1次，更换1个无菌吸头。
 
2、初发酵试验
① 提前通过RAYPA仪器预设参数：按LST肉汤配方（单料/双料）自动完成原料溶解、灭菌、恒温冷却，设定分装体积为 9mL（单料）或对应双料体积，将无菌试管置于仪器分装工位，自动定量分装 LST 肉汤，保证每管培养基成分均匀、体积精准，避免人工分装的量差与污染风险。
 
② 选择3个适宜连续稀释度的样品匀液（液体样品可含原液），每个稀释度对应3管 RAYPA预制的LST肉汤管。
③ 用Pipetty电动移液器，快速吸取1mL样品匀液接种至每管LST肉汤中；若接种体积超过1mL，直接接种至RAYPA预制的双料LST肉汤管中。得益于RAYPA预制培养基的提前准备和Pipetty的快速移液，从制备样品匀液到接种完毕，全程可高效控制在 15 分钟内。
④ 将接种后的 LST 肉汤管置于 36℃±1℃培养箱中，培养 24h±2h，检查产气情况。
⑤ 小倒管（RAYPA 分装时可同步预置）或产气收集装置内有气泡，或振摇后见细密气泡上升，判为产气，进入复发酵试验；未产气则继续培养至 48h±2h，仍未产气判为阴性。
若所有LST肉汤管 48h±2h 均未产气，直接按 MPN 检索表，报告 MPN/g (mL) 结果。
3、复发酵试验
① 通过 RAYPA 培养基自动制备分装仪，按 BGLB 肉汤配方完成标准化制备、灭菌及定量分装（每管预设体积），保证所有 BGLB 肉汤管的营养条件一致，避免人工配制导致的批次差异。
 
② 轻轻振摇产气的 LST 肉汤管，用无菌接种环取 1 环培养物，转种至 RAYPA 预制的 BGLB 肉汤管中。置于 36℃±1℃培养 24h±2h，检查产气情况。
③ 产气判为大肠菌群阳性；未产气则继续培养至 48h±2h，仍未产气判为阴性。
 
四、结果报告
1、若连续稀释度超过 3 个，选择其中最合适的3个连续稀释度。
2、依据3个适宜连续稀释度的大肠菌群阳性管数，查 MPN 检索表，以 MPN/g (mL) 表示每克（毫升）样品的大肠菌群含量，完成报告。