自然杀伤细胞（Natural Killer cells, NK细胞））是一种先天免疫系统的核心淋巴细胞，无需预先致敏即可识别并迅速杀伤病毒感染细胞、肿瘤细胞以及其他异常细胞，其名称中的“自然”一词，正体现了这种与生俱来的快速反应能力。NK细胞来源于骨髓造血干细胞，在骨髓、淋巴结等部位成熟，主要分布于外周血（约占淋巴细胞的5-20%）、脾脏、肝脏，也可浸润到炎症或肿瘤组织。在不同的组织中，NK细胞展现出不同的表型特征和功能特性，即使在同一器官或同一组织内，NK细胞也表现出高度的异质性，这意味着它们能够适应各种微环境并执行多种免疫功能，这种多样性和异质性使得NK细胞能够在机体的不同部位发挥其独特的免疫保护作用。NK细胞是当今免疫治疗，尤其是肿瘤治疗的前沿方向，而流式细胞术得天独厚的技术优势，成为检测和鉴定NK细胞最佳方式。

人源NK细胞流式鉴定： 

人源NK细胞通常定义为CD3- CD56+，还可以根据实验需要加入CD19-（排除B细胞）、CD14/CD66b（排除单核/粒细胞）等。

同时根据CD56和CD16的表达密度，人外周血NK细胞可分为两个主要功能亚群：

• CD56ᵇʳⁱᵍʰᵗ CD16ᵈⁱᵐ/⁻ （细胞毒功能弱）：约占10%，擅长分泌大量细胞因子，免疫调节功能强。

• CD56ᵈⁱᵐ CD16⁺ （强细胞毒性）：约占90%，构成主要细胞毒部队，杀伤能力极强。

小鼠源NK细胞流式鉴定： 

由于没有CD56同源物，常用标志物取决于小鼠品系：

1. NK1.1： 最常用，但仅存在于C57BL/6、BALB/c、NOD等少数品系，在129、FVB等品系中不表达或表达极低。

2. CD49b (DX5)： 一种整合素，是跨品系的泛NK细胞标志物，但需要注意它在部分激活的T细胞上也有低表达，且在肝脏等组织驻留NK细胞上表达可能为阴性。

3. NCR1 (NKp46)：这是目前公认的在所有品系小鼠以及人类中都保守的NK细胞标志物，因此，CD3⁻NKp46⁺是鉴定小鼠NK细胞最严谨的方案。

同时，小鼠NK细胞还可以根据CD27（一种TNF受体） 和 CD11b（整合素αM，Mac-1） 的表达，区分其发育和功能差异，进而分为不同的亚群。

• CD11blowCD27low：这是NK细胞发育的最早阶段。

• CD11blowCD27high：代表未成熟的NK细胞亚群。

• CD11bhighCD27high：这一亚群主要负责分泌细胞因子。

• CD11bhighCD27low：这是具有高细胞毒活性的成熟NK细胞亚群。

功能标志物鉴定：

除了以上鉴定标志物外，也有一些细胞相应的功能标志物可以采用流式检测。

CD69：首选早期指标，在NK细胞被细胞因子（如IL-2、IL-12、IL-15、IL-18）或靶细胞刺激后数小时内迅速表达，是判断NK细胞是否进入活化状态的“开关”性指标。

CD25：高亲和力IL-2受体α链，在细胞因子（IL-2）刺激后显著上调。是活化增殖的关键标志。

NKp44：活化NK细胞的经典受体标志，静息NK几乎不表达。常与CD56共标记以识别活化亚群。

CD107a（LAMP-1）：脱颗粒标志物，在NK细胞与靶细胞（如K562）共培养时，加入抗CD107a抗体直接到培养体系中。在脱颗粒过程中，CD107a会暴露在细胞膜上而被抗体结合。

IFN-γ：NK细胞功能中最核心、最常检测的细胞因子，一个能产生高水平IFN-γ的NK细胞，不仅自身有杀伤力，还能有效协调整个免疫系统，是NK细胞多功能性的关键组成部分。

TNF-α：其通过与靶细胞上的TNF受体结合，激活Caspase级联反应，直接诱导靶细胞凋亡，这是对穿孔素/颗粒酶途径的补充。检测TNF-α可帮助了解NK细胞是否启用了穿孔素/颗粒酶之外的凋亡诱导途径，有时可作为快速反应的指标，同时其与IFN-γ有强大的协同作用，两者结合能更有效地激活巨噬细胞，增强对肿瘤或感染细胞的清除。

颗粒酶B：一种丝氨酸蛋白酶，通过穿孔素形成的孔道进入靶细胞后，切割并激活凋亡通路的关键蛋白（如caspase），高效诱导靶细胞程序性死亡（凋亡），其存在和表达水平反映了NK细胞的杀伤潜能。

穿孔素：在靶细胞膜上聚合形成孔道，使水和离子通过，导致细胞肿胀破裂，并为颗粒酶进入创造通道，其存在和表达水平反映了NK细胞的杀伤潜能。

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