LNPs作为当前最先进的非病毒基因治疗载体，已成功应用于多种核酸的递送，包括siRNA、miRNA、mRNA以及质粒DNA和Cas9-sgRNA核糖核蛋白复合物。然而，实现LNPs在肝外器官的细胞特异性递送仍是一个尚未解决的难题。多肽因其独特的优势，成为LNPs修饰的理想靶向配体。

近期，美国加利福尼亚大学Ester J. Kwon团队在Journal of Controlled Release上发表题为“Formulation methods for peptide-modified lipid nanoparticles”的研究。本文旨在比较后修饰靶向法（PCT）和在线修饰靶向法（ILT）多肽修饰LNPs的制备方法，以评估其对LNPs功能特性的影响。

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Fig. 1. Formulation of peptide targeted LNPs through in-line or post-modification with five different peptide ligands.

体外转染效率、结合与摄取
研究以cRGD为例，评估了不同修饰量（0、0.17、0.3和0.5 mol%）对LNP转染效率的影响。实验结果显示，随着cRGD修饰量的增加，LNP的转染效率逐渐提高，在0.5 mol% cRGD修饰时达到最高转染效率，比未修饰时提高21倍（图2E）。进一步比较PCT和ILT法制备的0.5 mol% cRGD修饰LNPs，发现PCT法制备的LNP转染效率是ILT法的两倍以上（图2F）。

Fig. 2. Activity of peptide LNPs created through inline or post-modification

为了理解PCT和ILT法制备的LNP在转染效率上的差异，研究评估了它们在4°C（仅结合）和37°C（结合与摄取）下的细胞结合与摄取情况。

实验结果显示，在4°C下，cRGD修饰的LNP与细胞的结合能力显著提高，且PCT和ILT法制备的LNP结合能力相似（图3A-B）。在37°C下，cRGD修饰的LNP摄取量也显著增加，且两种方法制备的LNP摄取趋势一致（图3D-E）。这表明多肽修饰有效提高了LNP的细胞结合与摄取能力，但制备方法对结合与摄取过程的影响较小。

Fig. 3. Binding and uptake of ILT and PCT cRGD LNPs.

为了验证cRGD修饰的LNP是否通过特异性受体介导细胞摄取，研究进行了竞争结合实验。实验结果显示，在存在游离cRGD的情况下，cRGD修饰的LNP与细胞的结合和转染效率均显著降低（图4A-D）。这表明cRGD修饰的LNP确实通过特异性受体介导细胞摄取，且PCT法制备的LNP在竞争结合实验中仍表现出更高的转染效率。

Fig. 4. Binding and transfection of cRGD targeted LNPs is ligand specific.

体内转染效率与细胞趋向性
研究评估了cRGD修饰的LNP在体内的药代动力学和生物分布情况。实验结果显示，与未修饰的LNP相比，cRGD修饰的LNP在血液中的半衰期显著缩短（从41.8分钟缩短至10.5分钟和12分钟），表明靶向配体加速了LNP的清除（图5B）。在器官生物分布方面，cRGD修饰的LNP在肺和脾脏中的积累显著增加，而在心脏和肾脏中的积累减少（图5C-D）。这表明cRGD修饰有效改变了LNP的体内分布。

通过测量各器官中荧光素酶的表达量，研究发现cRGD修饰的LNP在肺和脾脏中的转染效率显著提高，而在肝脏中的表达降低（图5E）。这与生物分布结果一致，进一步证实了cRGD修饰对LNP体内转染效率的影响。值得注意的是，尽管PCT和ILT法制备的LNP在生物分布上相似，但PCT法制备的LNP在转染效率上仍表现更优。

Fig. 5. Comparison of pharmacokinetics and activity in healthy mice.

为了评估cRGD修饰的LNP在体内的细胞趋向性，研究使用了Ai9小鼠模型。实验结果显示，cRGD修饰的LNP通过PCT法制备后，其转染活性显著偏向于多器官的内皮细胞。在肺和心脏中，cRGD靶向LNP显著提高了内皮细胞中的报告基因表达（图6A-E）。这表明cRGD修饰的LNP能够有效靶向内皮细胞，实现细胞特异性递送。

Fig. 6. Cell tropism of cRGD PCT LNPs.

02 小结
本研究首次比较了PCT和ILT两种多肽修饰LNPs的制备方法，发现尽管两种方法制备的LNPs在物理化学性质上相似，但PCT法在体外转染效率和体内活性上均表现更优。这可能是由于PCT法中多肽修饰发生在LNP制备之后，对LNP内部结构影响较小，更有利于受体结合。此外，多肽修饰可能影响LNP的蛋白冠形成，进而影响其体内分布和细胞摄取。

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参考文献：Katelyn Miyasaki, Sangwoo Han, Olivia Carton, Rebecca M. Kandell, Jonathan Gunn, Ester J. Kwon. Formulation methods for peptide-modified lipid nanoparticles. Journal of Controlled Release, 2025, 385: 114030. DOI: 10.1016/j.jconrel.2025.114030.