mRNA技术在新冠疫苗中的成功应用，推动了其在癌症免疫治疗、遗传病修复等领域的广泛研究。然而，由于血脑屏障（BBB）的存在，mRNA药物难以有效递送至脑组织，限制了其在中枢神经系统疾病治疗中的应用。传统的递送方式如颅内注射存在创伤大、难以广泛覆盖脑区的问题，而系统性给药的脂质纳米颗粒（LNP）则多靶向肝脏，无法有效穿透BBB。

因此，开发一种安全高效、可规模化生产的脑靶向mRNA递送系统成为当前科研攻关的焦点。近日，董一洲院士团队在Science Advances上发表题为“Lipid nanoparticles for mRNA delivery in brain via systemic administration”的研究，报道了一种新型脑靶向LNP用于脑胶质瘤的治疗。

文中LNP使用了迈安纳(上海)仪器科技有限公司的纳米药物制备系统进行制备。

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01 实验结果
新型可离子化脂质的筛选与优化
SLNPs的合成与表征：本研究成功设计并合成了一系列基于SR-57227的离子化脂质（SLs），其结构包含SR-57227头部、氨基连接键和可生物降解的脂质尾部（图1A）。通过核磁共振氢谱和质谱验证了合成的SLs的结构准确性。进一步，将SLs与胆固醇（Chol）、二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE）、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-甲氧基聚乙二醇-2000（DMG-PEG2k）和荧光素酶（FLuc）mRNA混合，制备成SLNPs。动态光散射仪测定结果显示，SLNPs的粒径范围在120至180纳米之间，PDI均低于0.3，表明SLNPs具有良好的分散性。

体外mRNA递送效率评估：通过体外细胞实验，评估了不同SLNPs在N2a神经母细胞瘤细胞系、原代星形胶质细胞和bEnd.3脑内皮细胞系中的mRNA递送效率。实验结果显示，S0、S4和S6 LNPs在所有测试的细胞类型中均展现出最高的荧光素酶活性（图1B）。基于这些结果，选择S4 LNP进行进一步的体内验证。

Fig. 1. Construction of SLNPs for brain delivery.

体内mRNA递送效率优化：通过正交实验优化了S4 LNP的脂质成分比例，筛选出最优配方OS4 LNP（图2A-C）。

体内实验结果显示，静脉注射FLuc OS4 LNP后，脑组织中的荧光素酶活性显著高于MC3、SM-102和ALC-0315 LNPs，分别提高了约13.3倍、12.5倍、9.6倍和2倍（图2D, E）。这些结果表明，OS4 LNP在穿透BBB和递送mRNA至脑组织方面具有显著优势。

Fig. 2. Optimization and evaluation of S4 LNP for brain delivery.

细胞穿透肽修饰增强脑递送效率
CPPs修饰对LNP性质的影响：为了进一步提高OS4 LNP的脑递送效率，本研究通过点击化学将10种不同的细胞穿透肽（CPPs）修饰到OS4 LNP表面。实验结果显示，A5K、THR和LAH4肽修饰导致OS4 LNP发生聚集，粒径超过450纳米（图3B），因此排除了这些肽的进一步研究。

在剩余的7种CPPs中，pVEC、RVG和Tat肽修饰显著提高了OS4 LNP的脑递送效率，其中Tat肽修饰的OS4T LNP展现出最高的递送效率，比未修饰的OS4 LNP提高了约12.7倍（图3C）。

BBB穿透机制研究：通过Transwell迁移实验，研究了OS4和OS4T LNP穿透BBB的机制。实验结果显示，OS4 LNP的穿透作用主要通过巨胞饮作用和穴样内陷途径介导，而OS4T LNP则利用多种途径穿透BBB。

Fig. 3. The mRNA delivery efficiency and safety of CPP-conjugated OS4 LNPs.

不同脑细胞类型中的mRNA递送效率
GFP mRNA递送效率：通过静脉注射GFP mRNA负载的OS4T LNP至C57BL/6J小鼠体内，12小时后通过流式细胞术分析不同脑细胞类型中的GFP表达。实验结果显示，与MC3 LNP相比，OS4 LNP显著提高了神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞和脑毛细血管内皮细胞（BCECs）中的GFP表达（图4A）。Tat修饰进一步增强了OS4T LNP在这些细胞类型中的递送效率（图4A）。

Cre mRNA递送效率：在Ai14小鼠模型中，通过静脉注射Cre mRNA负载的OS4T LNP，7天后通过流式细胞术和免疫荧光成像分析tdTomato表达。实验结果显示，单次注射OS4T LNP后，神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞和BCECs中的tdTomato阳性细胞比例显著高于MC3 LNP组（图4B）。此外，三次注射OS4T LNP进一步提高了这些细胞类型中的基因编辑效率（图4B）。免疫荧光成像结果也证实了OS4T LNP在脑组织中的广泛递送（图4D-G）。

Fig. 4. OST4 LNP enables effective mRNA delivery into different brain cells.

胶质母细胞瘤治疗
eIL-12 mRNA的设计与验证：为了降低IL-12的系统性毒性，本研究设计了一种工程化IL-12（eIL-12）mRNA，其通过MMP9敏感的连接子与IL-12受体β1链融合（图5A）。体外实验结果显示，eIL-12能够在MMP9存在的情况下被切割，释放出具有生物活性的IL-12（图5B）。此外，与野生型IL-12 mRNA相比，eIL-12 mRNA在健康C3H/HeJ小鼠中表现出更好的耐受性（图5C）。

抗肿瘤治疗效果：在正位胶质母细胞瘤小鼠模型中，通过静脉注射OS4T LNP包裹的eIL-12 mRNA，评估其对肿瘤生长和生存期的影响。实验结果显示，与对照组相比，OS4T-eIL-12 LNP治疗显著抑制了肿瘤生长（图5E），并延长了小鼠的生存期（图5F）。治疗组小鼠的中位生存期延长至37天，是对照组（17天）的两倍以上。此外，治疗未引起显著的体重下降和其他副作用，表明OS4T-eIL-12 LNP具有良好的安全性和有效性。

免疫反应分析：通过流式细胞术和细胞因子检测，分析了OS4T-eIL-12 LNP治疗后的免疫反应。实验结果显示，治疗显著上调了脑组织中M1型巨噬细胞和 microglia 的标记物（CD80、CD86和iNOS）的表达，并减少了调节性T细胞的比例。同时，治疗还激活了CD8+ T细胞，表现为TNF-α+和CD69+ CD8+ T细胞比例的增加。此外，治疗组脑组织中的IFN-γ水平显著高于对照组，进一步证实了eIL-12的免疫激活作用。

Fig. 5. Therapeutic efficacy of OS4T LNPs in an orthotopic mouse model of GBM.

02 小结
本研究通过设计新型可离子化脂质并结合细胞穿透肽修饰，成功开发了一种能够高效穿透BBB的LNP系统（OS4T LNP）。该系统通过全身给药途径实现了mRNA在脑组织中的高效递送，并在胶质母细胞瘤小鼠模型中展现出显著的治疗效果。OS4T LNP的成功开发为中枢神经系统疾病的治疗提供了新的策略，并有望推动mRNA药物在脑部疾病中的临床应用。

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参考文献：Lipid nanoparticles for mRNA delivery in brain via systemic administration.