本文来源于微信公众： 生物制药小编 作者： wothman

T细胞接合器（TCE）一直是双抗领域中绕不开的一座大山。

在这种类型的双特异性抗体中，其中一端特异性通过其表面的CD3受体招募T细胞，另一端特异性通过肿瘤相关受体如EpCAM、CD19、CD20、BCMA、GPRC5D或DLL3结合癌细胞上的肿瘤相关抗原，从而实现将免疫细胞直接动员至肿瘤部位，在那里它们激活免疫细胞介导的抗肿瘤免疫反应，同时不伤害健康细胞。

自从2014年以来，TCE已经在血液肿瘤中获得了惊人的成功，虽然有效，但是安全和剂量限制毒性问题不可忽视。尤其是细胞因子释放综合征（CRS）常常会限制TCE双抗的使用。

与T细胞不同，NK细胞无需预先致敏即可快速识别并摧毁异常细胞，且副作用相对温和。采用NK细胞作为NK细胞接合器（NKCE）的策略已有多家Biotech企业尝试开发中。

最近OmniAb公司就在mAbs发布了该公司的NKCE平台技术，不过让人意想不到的是，这个技术平台以“鸡”这种动物的抗体作为技术核心之一。

通用轻链和鸡鼠平台
开发双特异性抗体面临一个主要技术难题：轻链错配。一个典型的抗体由两条重链和两条轻链组成。在实验室中同时生产两种不同的抗体“半成品”（分别针对A靶点和B靶点）时，它们的重链和轻链很容易随机组合，产生四种组合，由于目标只有一种，那么就产生了大量非目标产物，严重影响纯度和产量。

因此，科学界常常采用“共同轻链”（cmLC）技术，指的是靶向不同targets的不同抗体中所使用的轻链是一致的。这样，在组装针对不同靶点的抗体时，就完全避免了轻链的混乱配对，使得大规模生产高质量的双特异性抗体成为可能。

2017年获批的血友病药物emicizumab（Hemlibra®）就是首款成功的cmLC双抗。不过要如何快速筛选出这种cmLC双抗呢？

研究团队采用两个互补的动物平台，它们都能产生全人源序列的cmLC抗体。

OmniClic™ 和 OmniFlic®。它们都基于“通用轻链”（cmLC）技术，能产生完全人源序列的抗体，但宿主动物截然不同——前者使用基因工程改造的鸡，后者则使用大鼠。

哺乳动物（包括人类和大鼠）通过V（D）J重组机制产生抗体多样性，即从多个基因片段中随机拼接出不同的重链和轻链。

而鸡则采用一种名为“基因转换”（gene conversion）的独特机制：它们只有一个功能性重链V基因，但通过高频替换其可变区，从一系列伪基因中拷贝小片段DNA来对其进行修饰和多样化，也能生成高度多样化的抗体库。

这种进化上的“另类路径”，使得鸡对人类抗原可能产生与哺乳动物完全不同的识别方式，从而挖掘出全新的抗体表位。而大鼠等哺乳动物与人类更近缘，它们的免疫系统可能觉得NKp46似曾相识，从而跳过某些表位，限制了抗体表位多样性。研究假设：联合使用Clic和Flic平台，可以获得比任何单一平台更全面、互补的抗体库。

研究团队以NK细胞上的重要激活器NKp46为模型靶点开展实验。他们分别用NKp46蛋白免疫OmniClic鸡和OmniFlic大鼠，随后从单个B细胞中分离出特异性抗体，并对其亲和力、表位覆盖范围及功能活性进行全面评估。

鸡鼠互补
研究的核心突破在于对表位多样性的深度解析。表位是抗原上被抗体识别的具体区域，不同表位的抗体可能触发不同的生物学效应。拥有针对多个不同表位的抗体，对于设计最优化的疗法至关重要。

团队采用高通量表面等离子共振（SPR）技术，对119个抗体克隆进行了“表位分箱”（epitope binning）分析——即测试任意两个抗体是否能同时结合NKp46，若不能，则说明它们识别的是重叠或邻近的表位。

研究结果显示：OmniFlic大鼠平台成功重现了文献中已知的四个经典NKp46抗体（Innate-1至4）所对应的全部四个表位群；

而OmniClic鸡平台虽仅重现其中一个（Innate-2），却发现了六个全新、鼠类平台无法产生的独特表位群，这证明了研究人员最初的假设，即使用鸡源平台能够提供一个完全不同的视角来更好找到新表位；

两个平台共识别出14个不同的表位社区（communities），其中仅有2个为共享，其余均为各自独有。

随后，研究人员还利用氢氘交换质谱（HDX-MS）这项技术通过测量蛋白质主链氢原子与溶液中氘原子的交换速率，定位抗体结合后受保护的区域。

结果验证了SPR分箱结果的可靠性。如Com-4C1能结合L39-F62区域，与Innate-4基准重叠。Com-3（如dAb D01）可结合H108-F121，位于蛋白远端的独特口袋。Com-2a以L135-Y147为核心，但成员间有细微差异。最引人注目的是C08——一个Clic抗体，拥有从未见过的独特表位（Com-2U），直接与Innate-1基准竞争，这表明它结合了一个关键的功能区域。

ADCC实战检验
研究人员将三个代表性抗体（分别来自鸡和鼠的不同表位群）改造为EGFR/NKp46双特异性抗体，采用Morrison格式（2+2四价结构，两个NKp46臂和两个EGFR臂）。这种四聚体结构像分子交联剂，强制NK细胞与肿瘤细胞亲密接触。利用经典的A549肺癌细胞系和人源NK细胞进行抗体依赖性细胞毒性（ADCC）实验。

他们测试了两种配置：将EGFR臂连接在NKp46抗体的重链或轻链末端，并使用活性Fc（结合CD16a）或“沉默”Fc。

他们发现了以下三种规律：
①所有测试的双抗均能在无Fc效应功能（即沉默Fc，排除CD16a通路干扰）的情况下介导肿瘤杀伤，证明单纯激活NKp46就足以触发NK细胞杀伤活性。
②活性Fc未增效，最佳表现者反而是Flic来源的F15的沉默Fc轻链连接版本，显著优于活性Fc版本，甚至超过西妥昔单抗对照。
③轻链大于重链，将EGFR-scFv连接在抗体轻链末端（LC-tethered）的格式，比连接在重链末端（HC-tethered）更有效。

传统上，科学家通常认为激活FcγRIIIa（CD16a）能增强ADCC。但在此系统中，同时激活NKp46和CD16a反而可能因空间位阻或信号干扰而降低效率。

这表明，在设计NKCE时，还需要考虑分子几何结构与价态问题，并非激活越多就越好。

总结
总的来说，这项研究证明了OmniClic平台可以作为啮齿类系统的可行替代，同时也说明了NKCE开发的复杂挑战，还有更多的基础研究有待开发，期望未来NKCE相关平台能有更好发展。