HyClone™ peak expression 培养基是一种无动物源性成分 (ADCF)、无水解物且监管友好的细胞培养基。这种培养基的用途广泛，可提高转染效率，确保细胞生长一致，提高活细胞密度，并具有优异的病毒滴度，适用于多种 HEK 293 细胞系和 AAV 血清型。HyClone™ peak expression 培养基为支持出色性能的小规模和大规模生产工艺使用而生，使用标准的商业化细胞系和工艺，可支持从细胞生长到AAV生产的无缝过渡。HyClone™ peak expression 培养基有液体和粉末两种规格，并采用用户友好型包装。

HyClone Peak Expression培养基是一款专为培养HEK293细胞生产rAAV所设计的产品。

无动物源性成分（ADCF）

无血清，无水解物

含稳定型谷氨酰胺及泊洛沙姆188

支持高密度细胞生长

提升转染效率和病毒包装能力

1 、室温条件下（20℃-25℃），在洁净容器中加入终体积90%的细胞培养级纯水（例如配制1L的Peak Expression 液体培养基，在容器中先加入900ml纯化水），并开始搅拌。

2 、沿漩涡中心缓慢加入25.17 g/L Peak Expression干粉培养基，以避免结团。搅拌20分钟直至所有干粉溶解。

3 、缓慢加入2.5 g/L碳酸氢钠。搅拌10分钟直至所有干粉溶解。

注：此步骤后溶液呈淡黄色，无颗粒。在调节pH之前，溶液可能呈轻微浑浊。

4 、用5 N NaOH或HCl逐滴加入，调节pH至7.0-7.4。

5 、加入细胞培养级纯水，定容至终体积。

6 、测定最终pH和渗透压：pH须在7.0-7.4之间，渗透压须在300至340 mOsm/Kg之间。

7 、使用0.2 µm滤器进行除菌过滤。

8 、2℃-8℃避光保存。

细胞株驯化

使用 HyClone Peak Expression 培养基通过对 HEK 293.2 sus 细胞 (ATCC) 进行直接驯化。种子细胞培养从原培养基中直接接种至HyClone Peak Expression，接种密度为 5.0 × 105 个细胞/mL。每 3 至 4 天在进行传代，连续培养12代以上，直至细胞的群体倍增时间 (PDT)达到24 到 30 小时之间，并且细胞活率高于90%。

摇瓶培养

将 HEK293.2 sus 细胞接种于装有 30 到 50 mL HyClone Peak Expression 培养基的 125 mL 摇瓶中，接种密度为 0.4 ×106 个细胞/mL。在振荡培养箱中以 140 rpm、37°C 和 5% CO2 的条件进行培养。当细胞计数和活率下降到一定程度时终止培养。细胞培养按三次重复进行。

病毒增殖和滴度测定

通过三质粒转染系统对细胞进行转染。该系统由一个递送腺病毒基因的 pHelper 质粒、一个 Rep/Cap（复制和衣壳蛋白）质粒和另一个在末端反向重复序列 (ITR) 之间包含有目的基因（GOI，在本研究中是指绿色荧光蛋白 [GFP]）的质粒组成，这三个质粒对于将目的基因包装到 AAV 衣壳中必不可少。helper: Rep/Cap: GOI 质粒的比例为 2.0:1.5:1.0。在密度为 2 × 106 个细胞/mL 的培养物中，以 2:1（PEI 比 DNA）的比例使用线性化聚乙烯亚胺 (PEI, Polysciences Inc.) 诱导转染。收获时间 (TOH) 为转染后第 4 天，通过微滴式数字 PCR (ddPCR) 检测绿色荧光蛋白 (GFP) 转基因盒，从而确定病毒滴度。

采用 100 μL 的 10× 裂解缓冲液（5% Tween 20、10 mM 氯化镁、200 mM Tris，pH 8.0）和 20 U/mL Turbonuclease 酶在摇床中对大约 900 μL 培养物进行处理（37 ℃，持续 4 小时）。将等分试样以 15000 × g 离心 10 分钟，并对粗裂解上清液进行 ddPCR 分析。

生物反应器培养

以 0.5 × 106 个细胞/mL 的密度将 HEK 293.2 sus 细胞接种于装有HyClone Peak Expression 培养基的一次性 Xcellerex XDR-10 L 细胞培养袋中，生物反应器的最终批体积为 9 L。使用表 1 中列出的培养参数，在 XDR-10 生物反应器中进行细胞培养。将细胞从摇瓶移到 WAVE 生物反应器（Xuri 细胞扩增系统 W25）中，再移到 XDR-200 生物反应器中，以此进行扩增。

在连续传代过程中，我们在摇瓶中用 HyClone Peak Expression 培养基培养了不同代次的细胞，培养时间最长达 13 天。对 VCD、细胞活力和 PDT 进行全程监测。我们可以从下图 中看出，细胞生长密度范围在 6.0 至 9.0 × 106 个细胞/mL 之间。

转染条件

采用三重质粒转染法对已驯化的 HEK293.2 悬浮细胞进行瞬时转染。在该过程中，线性化聚乙烯亚胺 (PEI) 与 DNA 形成复合物，然后被导入到宿主细胞中。使用绿色荧光蛋白 (rAAV5-GFP) 对摇瓶中的 HEK293.2.sus细胞进行转染，质粒的使用量为 每2 × 106个细胞对应 2 μg DNA。

为研究该培养基对 PEI-DNA 复合物稳定性的影响，测试了转染复合物在HyClone Peak Expression 培养基中的占比（占rAAV生产总体积的5% 或10%）。每种条件按三次重复在摇瓶中进行实验。结果显示 占比为10% 时，一致性较好，因此在使用 HyClone Peak Expression 培养基的rAAV 生产实验中，推荐使用该体积。

rAAV产率提升

我们评估了 rAAV5 在两种不同培养基（HyClone Peak Expression 培养基和原培养基）中的产率。滴度测定结果以 GC/L（基因组拷贝数/升）为单位，对四次重复实验进行比较。

我们发现与原培养基相比，使用 HyClone Peak Expression 培养基时的滴度 (GC/L) 增长至 4 倍 (p < 0.05)，如下图所示。使用 原培养基时的收率（GC/细胞）为 2.6 × 104 GC/细胞，而在使用 HyClone Peak Expression 培养基的样品中，我们观察到收率为 6.8 × 104 GC/细胞，相当于增长至两倍多，未显示相关数据。

在生物反应器中放大 rAAV5 生产

最后，我们将 rAAV5-GFP 的生产进行了放大，由摇瓶培养改为用 10 L 规格的 Xcellerex XDR-10 生物反应器培养，然后用 200 L 规格的 XDR-200 生物反应器进一步放大培养。结果显示，虽然相较与摇瓶培养的产率稍有下降，但总体来说该工艺可在 10 L 至 200 L 生物反应器之间进行放大。GFP 的百分比峰值出现在转染后第 48 小时（未显示相关数据）。

培养基中的泊洛沙姆对rAAV产率的影响

为避免聚集，对抗剪切损伤，并促进悬浮培养的细胞生长，通常在生长培养基中使用泊洛沙姆。尽管收率没有显著的统计学差异，我们仍然发现，在 PEI 和 DNA 复合物中未添加 Pluronic F-68 的情况下，rAAV 产率低于 1.8 × 1014 GC/L，反之，rAAV 产率高于 1.8 × 1014 GC/L。

我们对于思拓凡的 HyClone Peak Expression 培养基的观察结果如下：

HyClone Peak Expression 培养基具有完整的补料成分，无需额外添加其他培养物料，因而其上游工艺简单而稳健，可重现性更好。

细胞经过冷冻保存后复苏良好，培养条件稳定。

在摇瓶中的高密度培养可达到 9.0 × 106 个细胞，可进行 rAAV 批量生产。

采用 HyClone Peak Expression 培养基可以将工艺规模从摇瓶放大至 200 L。

我们发现，与原培养基相比，rAAV 收率增长至 4 倍。

当占生产体积 10% 时 DNA-PEI 复合物一致性较好。

泊洛沙姆对 DNA-PEI 复合物的形成及后续转染没有影响。

综上所述，Cytiva（思拓凡）作为生物制药领域具备高合规资质的头部供应商，其旗下HyClone™ Peak Expression培养基完全满足“无动物源”核心要求——明确标注无动物源性成分（ADCF）、无血清、无水解物，从源头规避了动物源污染风险；同时，该产品具备监管友好的配方设计，适配从摇瓶到200L生物反应器的规模化生产，且品牌依托成熟的质量控制体系（符合生物制药领域严苛的生产规范），可提供完整的合规性支持文件，充分契合“符合药典标准”的应用需求。
无论是基因治疗中rAAV的高效生产，还是其他对培养基安全性、一致性有严格要求的生物制药场景，Cytiva（思拓凡）的HyClone™ Peak Expression培养基都是兼具可靠性与实用性的优选方案，其品牌资质与产品性能均能为相关生产工艺的合规性、稳定性提供有力保障。