ELISA实验中封闭剂的种类及其对特异性的影响
2026-01-28 来源:本站 点击次数:233
在ELISA实验中，抗原或抗体包被固相载体（如微孔板）后，表面仍存在未被占据的结合位点。若不加以处理，这些空隙会非特异性吸附后续加入的抗体或其他蛋白，导致高背景、假阳性等问题，严重影响检测的特异性。因此，“封闭”这一步骤至关重要——它通过用大量无关蛋白质填充这些空位，有效阻断干扰物质的再吸附，从而提升信噪比与结果可靠性。
封闭剂种类及其对特异性的影响
牛血清白蛋白（BSA）
是最常用的封闭剂之一，因其成分单一、批间差异小，适用于大多数ELISA实验，尤其适合对特异性要求较高的检测。
优点在于不含生物素和碱性磷酸酶残留，可用于生物素-亲和素系统或AP标记体系，避免交叉反应。
注意事项：部分市售BSA可能含有少量抗体残留，可能导致轻微背景升高；若目标抗原为BSA偶联物，则不可使用BSA封闭，以免产生交叉反应。
脱脂奶粉
成本低廉且封闭效果全面，因含有多种不同分子量的蛋白，能更充分地覆盖膜或板上的异质性结合位点。
缺点是成分复杂，可能引入干扰因子。例如，脱脂奶粉中含有内源性生物素和碱性磷酸酶，因此不能用于生物素标记或碱性磷酸酶检测系统，否则会造成严重背景干扰。
此外，奶粉中的酪蛋白等成分可能与某些抗体发生非特异性结合，影响特异性。
动物血清（如正常山羊血清、胎牛血清）
特别适用于含有Fc受体的样本（如组织匀浆、全血），因为血清中的IgG可特异性封闭样本中的Fc受体，防止一抗或二抗与其非特异性结合，这是BSA无法实现的功能。
建议选择与二抗来源不同的物种血清进行封闭，以避免交叉反应。
需注意某些封闭血清可能含叠氮钠（防腐剂），会抑制HRP酶活性，故不适用于辣根过氧化物酶（HRP）标记系统。
酪蛋白（Casein）
作用机制类似BSA，但溶解度较低，需注意配制方法。
在特定条件下（如中性或碱性环境）表现出优于BSA的封闭性能，尤其适用于降低高背景信号。
不推荐用于磷酸化蛋白检测，因可能影响磷酸化表位识别。
无蛋白封闭剂（化学合成型）
新型高效封闭剂，由高亲水性化合物构成，无生物来源成分，彻底规避了生物制剂带来的批间差、免疫原性和交叉反应风险。
具有纯度高、稳定性好、兼容性强的优点，特别适用于多重检测、化学发光或乳胶比浊等高端免疫分析平台。
可作为BSA的替代品，甚至与其联合使用以进一步降低基质干扰。
正确选择封闭剂能显著提高ELISA的特异性。一般情况下，BSA是最安全通用的选择；当涉及Fc受体干扰时，优先考虑同源动物血清；对于生物素/酶标记系统，应避开含相应干扰物的脱脂奶粉；而在追求更高稳定性和低背景的应用中，可选用酪蛋白或无蛋白封闭剂。最终选择应结合预实验测试多种封闭条件，优化出最适合自身体系的方案。
封闭剂种类及其对特异性的影响
牛血清白蛋白（BSA）
是最常用的封闭剂之一，因其成分单一、批间差异小，适用于大多数ELISA实验，尤其适合对特异性要求较高的检测。
优点在于不含生物素和碱性磷酸酶残留，可用于生物素-亲和素系统或AP标记体系，避免交叉反应。
注意事项：部分市售BSA可能含有少量抗体残留，可能导致轻微背景升高；若目标抗原为BSA偶联物，则不可使用BSA封闭，以免产生交叉反应。
脱脂奶粉
成本低廉且封闭效果全面，因含有多种不同分子量的蛋白，能更充分地覆盖膜或板上的异质性结合位点。
缺点是成分复杂，可能引入干扰因子。例如，脱脂奶粉中含有内源性生物素和碱性磷酸酶，因此不能用于生物素标记或碱性磷酸酶检测系统，否则会造成严重背景干扰。
此外，奶粉中的酪蛋白等成分可能与某些抗体发生非特异性结合，影响特异性。
动物血清（如正常山羊血清、胎牛血清）
特别适用于含有Fc受体的样本（如组织匀浆、全血），因为血清中的IgG可特异性封闭样本中的Fc受体，防止一抗或二抗与其非特异性结合，这是BSA无法实现的功能。
建议选择与二抗来源不同的物种血清进行封闭，以避免交叉反应。
需注意某些封闭血清可能含叠氮钠（防腐剂），会抑制HRP酶活性，故不适用于辣根过氧化物酶（HRP）标记系统。
酪蛋白（Casein）
作用机制类似BSA，但溶解度较低，需注意配制方法。
在特定条件下（如中性或碱性环境）表现出优于BSA的封闭性能，尤其适用于降低高背景信号。
不推荐用于磷酸化蛋白检测，因可能影响磷酸化表位识别。
无蛋白封闭剂（化学合成型）
新型高效封闭剂，由高亲水性化合物构成，无生物来源成分，彻底规避了生物制剂带来的批间差、免疫原性和交叉反应风险。
具有纯度高、稳定性好、兼容性强的优点，特别适用于多重检测、化学发光或乳胶比浊等高端免疫分析平台。
可作为BSA的替代品，甚至与其联合使用以进一步降低基质干扰。
正确选择封闭剂能显著提高ELISA的特异性。一般情况下，BSA是最安全通用的选择；当涉及Fc受体干扰时，优先考虑同源动物血清；对于生物素/酶标记系统，应避开含相应干扰物的脱脂奶粉；而在追求更高稳定性和低背景的应用中，可选用酪蛋白或无蛋白封闭剂。最终选择应结合预实验测试多种封闭条件，优化出最适合自身体系的方案。
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