• 核心变化：从“固定程序”转向基于风险评估（Risk Assessment）的方法选择，强调科学决策。
• 技术升级： 核酸扩增技术（NAT）地位提升，成为与培养法并列的核心方法，并建立了详细的验证标准。
• 操作规范： 明确了“上清+细胞”的联合取样要求，以确保检测的全面性。
• 质量控制： 新增了针对NAT和指示细胞法的抑制物测试要求，强化了检测结果的有效性。

• 支原体属（Mycoplasma）
• 支原体形属（Mycoplasmoides）
• 中支原体属（Mesomycoplasma）
• 后支原体属（Metamycoplasma）
• 支原体虫属（Mycoplasmosis）
• 脲原体属（Ureaplasma）
• 无胆甾原体属（Acholeplasma）
• 螺原体属（Spiroplasma）

而旧版仅笼统称为“mycoplasmas”。

（2）引入风险评估原则
新版重点强调方法选择应基于风险评估（risk assessment），需考虑培养基、生产工艺、产品类型、潜在污染物种类等因素。这是一个根本性的理念转变，从固定的程序转向基于科学的风险管理。

（3）明确取样要求
新版新增并强调：由于支原体可能附着或存在于细胞内，检测时应同时取样细胞和上清液（whenever possible）。

（4）增加抑制物测试
除了在培养法延续保留抑制物测试，在指示细胞法和核酸法都新增了抑制物测试，并提出了具体方案和测试内容。

02 关于核酸扩增技术（NAT）
（1）地位明确
在新版开篇即介绍了“本章描述了三种支原体检测方法：培养法、指示细胞培养法和核酸扩增技术（NAT）”，再次明确了“在经过适当验证后，NAT可作为上述一种或两种方法的替代方法。”

（2）分类细化
新版将NAT细分为三种应用模式：

• 直接NAT（Direct NAT）
• 基于细胞的富集后NAT（Cell-based enrichment followed by NAT）
• 基于培养基的富集后NAT（Media-based enrichment followed by NAT）

（3）验证要求具体化
新版为NAT提供了极其详细的验证指南，包括：

• 明确的可比性标准：作为培养法替代方法需达到≤10 CFU/mL的灵敏度；作为指示细胞法替代方法需达到≤100 CFU/mL的灵敏度。
• 参考标准品：引入了WHO支原体DNA国际标准品（WHO IS for mycoplasma DNA）作为校准工具。
• 菌株表征：对用于验证用的菌株制备和表征提出了明确要求。其中，对活菌参考品同时进行CFU（菌落形成单位）和GC（基因组拷贝数）的测定，并定义了GC/CFU比率（应<10）的接受标准，使NAT结果更具可比性和可靠性。
• 检测限：应使用一组已表征和校准的菌株进行一系列的稀释。如果仅使用DNA标准品应加以论证。
• 抑制性物质测试：为NAT专门提出了抑制性物质测试要求，并在验证指南中示例了测试方案。

03 培养法与指示细胞法的优化
（1）明确培养条件适用性
培养法与指示细胞培养法仅适用于最适生长温度35–38℃的菌种；未提及的产品相关菌种或检测昆虫、鱼类、植物细胞系等其他细胞生产系统可能需另设条件。

（2）抑制性物质测试
新版培养法里继续沿用旧版的抑制性物质测试内容，在指示细胞法新增抑制性物质测试，强调了抑制性物质测试是针对特定产品的，且在工艺变更后需重新进行。新版EP2.6.7培养法和指示细胞法在遇到抑制性物质时的处理策略有不同侧重点：

i. 培养法中的抑制性物质处理方式
主要策略：稀释 (Dilution)

• 原理：通过降低待检产品在培养基中的最终浓度，来减弱或消除其抑制效应。
• 验证：必须通过重复抑制性物质测试来证明所采用的稀释方案能有效中和抑制作用。

• 同样适用！新版EP明确指出：“若进行样品稀释，可使用更大体积的培养基或将接种物体积分配到多个细胞培养容器中。”
• 这与培养法的思路一致，通过降低产品浓度来减轻对细胞的毒性或对支原体附着的干扰。

• 特指针对病毒产品的场景。
• 原理：如果待检产品是具有细胞病变效应（CPE）的病毒悬液，病毒本身会杀死指示细胞，导致无法观察。此时，可以使用对该病毒有特异性、但对支原体无抑制作用的抗血清来中和病毒的感染性，从而保护指示细胞。
• 关键点：“中和”在这里是一个非常具体的操作，专指用抗血清对抗病毒，而不是泛指所有抑制性物质的处理。

• 新版EP提到，在某些复杂情况下，可以采用“检测对照细胞”等替代方法，但这些方法必须经过充分论证并获得监管机构批准。

04 理念与措辞的与时俱进
（1）联合使用原则的灵活性
旧版规定“必须”（are used）联合使用两种方法。新版改为“应联合使用（should be used conjointly）”，但增加了重要的例外条款：“除非各论另有规定，或经风险评估证明并获得主管当局授权”，确保“可培养”和“不可培养”支原体的检出。这体现了监管的灵活性和基于科学决策的原则。

（2）强调“有效性”（validity）
新版在结果解释部分更清晰地定义了试验无效的各种情况，强化了质量控制的概念。

新版EP 2.6.7相较于旧版，其核心变化在于：

1. 从固定程序到基于风险：引入风险评估作为方法选择的基础。
2. 全面拥抱NAT技术：将NAT的地位提升至核心方法，并为其建立了全面、严谨、可量化的验证和应用框架。
3. 内容更全面、精确：更精确地明确了支原体检测范围（如螺原体），细化了操作要求、明确了取样策略。
4. 语言和结构更现代化：文本结构清晰，逻辑严谨，术语准确，更符合当前GMP和监管科学的要求。

这些修改反映了近几年生物制药行业，特别是在细胞库、病毒载体和先进治疗产品（ATMPs）等领域的发展，以及对快速、灵敏、可靠的支原体检测方法的迫切需求。

相比于其他国家药典，EP 2.6.7较早收录了NAT方法。到目前为止，我国药典还没有支原体NAT法章节。在实际检测实践中，我们常参照EP 2.6.7。新版EP 2.6.7的修改对我们实际的支原体检测实践具有重要的参考和指导意义。

湖州申科开发了系列支原体DNA提取、检测试剂盒及验证菌株，符合新版《欧洲药典》支原体检测要求，助力产品合规放行。