全外显子组测序（WES）已成为医学遗传学诊断的核心工具。然而，市售WES试剂盒在探针设计（如ssRNA vs dsDNA）、靶向区域大小和建库方法上差异显著。过往多数对比研究仅局限于外周血样本，而临床实践中大量遇到的羊水、绒毛膜绒毛（CVS）、干血斑（DBS）、成纤维细胞等非血液样本，因采集条件、提取方法或长期储存导致DNA质量受损，其对不同试剂盒的稳健性提出了更高要求，但缺乏系统性评估。

2026年7月14日，巴塞罗那临床医院（Hospital Clínic de Barcelona）团队在 International Journal of Molecular Sciences 发表了一项对比研究，首次系统评估了三种主流WES试剂盒（Illumina、Agilent、Twist）在多种真实临床组织样本中的表现，Twist Exome 2.0在覆盖均匀性、基因覆盖度和难测区域捕获方面全面领先，尤其在非血液低质量DNA样本中优势最为显著。

研究设计
一、研究对象
研究团队选取了三种在欧洲分子诊断实验室中广泛使用的商业化WES试剂盒：

1. Agilent SureSelect V8 ：80-mer ssRNA探针，靶向区域35.1 Mb；
2. Illumina DNA Prep Exome 2.5：120-mer dsDNA探针，靶向区域37.8 Mb；
3. Twist Exome 2.0 Plus :120-mer dsDNA,靶向区域37.8 Mb；

二、样本组成
研究分两个阶段进行：

• 比较阶段（8样本）：4份外周血 + 4份非外周血（羊水2份、胎儿组织1份、成纤维细胞1份），同时使用三种试剂盒建库测序。
• 验证阶段（24样本）：使用第一阶段表现较优的Twist试剂盒，对先前已用Agilent测序过的临床样本进行重测序验证。包含12份外周血 + 12份非外周血（羊水5份、胎儿组织2份、绒毛膜绒毛2份、干血斑3份）。

三、分析框架
采用自建Nextflow流程（BWA-MEM比对，Mosdepth/Picard质控）。临床相关区域定义为PanelApp UK数据库451个基因面板覆盖的4100个临床基因。难测区域（DTS）采用Hijikata等定义的795个短读长测序困难区域（涉及175个基因）。

核心结果
一、覆盖均匀性

四、难测区域（DTS）捕获

研究还评估了一个极具挑战性的指标——795个被定义为"短读长测序困难区域"（Difficult-to-Sequence, DTS）的临床相关区域（Hijikata et al., 2025）。
 

这一结果对临床诊断意义重大——许多致病突变恰好位于这些"难测区域"中，捕获能力的差距直接关系到检出率。

讨论与启示
一、技术原因解析
Illumina与Twist使用相同的120mer dsDNA探针和相同靶区BED文件，性能差异大，说明探针化学修饰、封闭试剂、杂交缓冲液、洗脱条件等“软实力”对最终捕获效果影响深远。

Twist更倾向捕获外显子邻近区域，导致on-target比例略低，但换来了更均匀的全靶区覆盖——这是一种“战略性取舍”，对CNV检出和稀有变异检测更友好。

二、临床适用场景推荐
外周血高质量DNA：三家均可，但Twist能以更低测序数据量达到同等诊断灵敏度，节省测序成本；

产前样本（羊水/绒毛）：推荐Twist，其88.98%的38×覆盖率优于Agilent的72.15%，可避免因覆盖不足导致的假阴性或漏诊；

干血斑、培养细胞、FFPE：Twist的高均匀性和低重复率使其成为首选，文献亦支持其在降解样本中的优越性。

三、成本效益
研究团队表示，更换为Twist试剂盒后，每批次可上样更多样本，手工操作时间减少，单样本试剂成本下降，实现了“提质增效降本”三赢。

本文由杭州沃森生物整理解读，相关数据及结论引自原始文献，仅供学术交流。如有不妥请联系删除。文章来源：https://www.mdpi.com/1422-0067/27/14/6261