批培养/补料/ATF灌流三种工艺方案全验证
摘要：本文基于PBS Biotech与GeneFab联合发布的白皮书，验证了PBS垂直轮生物反应器的CAR-NK扩增工艺。经0.1L小试参数优化、3L中试对比三种培养模式，结果显示灌流工艺可使细胞扩增倍数提升2.6倍，细胞杀伤效力优于静态培养，且系统线性放大性优异，为CAR-NK临床级规模化生产提供数据支撑。

关键词：垂直轮生物反应器、PBS Mini、CAR-NK、PBS 3L、ATF灌流工艺、补料批培养、PBS垂直轮生物反应器、CAR-NK高密度扩增、工艺放大、批培养、NK细胞扩增

随着NK细胞免疫疗法在肿瘤、自身免疫病等领域的临床推进，如何实现稳定、可放大的临床级细胞扩增，成为行业普遍关注的核心问题。传统静态培养体系存在操作繁琐、污染风险高、批培养一致性差、放大难度大等短板，难以匹配商业化生产需求。

近期，PBS Biotech联合GeneFab发布专项白皮书，以人外周血来源CAR-NK为研究对象，在PBS垂直轮生物反应器（点击查看）体系内，系统验证了批培养、补料批培养、ATF灌流三种培养策略的扩增表现，完成了从0.1L小试到3L中试的全流程工艺验证，为CAR-NK规模化生产提供了实测数据参考。

图1.PBS Mini垂直轮反应器系列，包括PBS Mini基座（非一次性）和一次性耗材两部分，其中耗材有0.1L和0.5L两种耗材规格。

一、研究设计：覆盖从小试到中试的全流程验证
该研究中采用经辐照K562滋养层激活、逆转录病毒转导的CAR-NK细胞，分别在PBS-0.1Mini（100mL工作体积）与PBS-3（3L工作体积）垂直轮生物反应器中开展实验，核心评估维度包括：

• 搅拌转速、接种密度等关键工艺参数优化
• 批培养、补料批培养、灌流三种培养模式的扩增效率对比
• 细胞活率、凋亡水平、CAR表达、杀伤效力等质量属性评价
• 从小试到中试的工艺放大一致性验证

图2.补料批培养培养与灌流培养体系下，NK细胞从活化、扩增至冻存的工艺流程示意图

二、PBS Mini 0.1L小试：初步锁定核心工艺参数
PBS Mini 0.1L作为低成本的缩小模型，可快速完成工艺参数筛选，降低中试开发风险。研究针对搅拌转速、接种密度两大核心变量开展了系统优化：

1.搅拌转速：30-50rpm为较优区间
研究测试了10、30、50、100rpm四档转速：

• 10rpm：混合效率不足，出现明显细胞沉降与团聚，扩增受限
• 100rpm：剪切应力提升，细胞凋亡比例增加，影响细胞健康状态
• 30/50rpm：可支持稳健的细胞扩增，其中30rpm批培养模式下，12天扩增倍数可达36倍，效果优于10rpm组

表1.PBS-0.1中参数评估与扩增结果

2.接种密度：低接种密度实现更高扩增倍数
测试了5×10⁴、1×10⁵、2.5×10⁵、4×10⁵cells/mL四档接种密度（补料批培养模式）：

• 5×10⁴cells/mL：扩增倍数较优，10天可达50倍
• 随接种密度升高，扩增倍数逐步下降；高接种密度下营养消耗更快，生长平.台期更早出现
• 综合总细胞产量与工艺效率，从而选择1×10⁵cells/mL作为中试放大的基准接种密度

此外，培养基中添加1g/LPluronicF-68作为剪切保护剂，可进一步降低搅拌过程中的细胞损伤，提升培养体系稳定性。

图3A-B.30rpm与50rpm搅拌转速下的细胞扩增倍数，约为10rpm组的2倍。培养12天后，葡萄糖浓度降至约1.5g/L，乳酸浓度升至约1.4g/L。
 

图3C-D.100rpm恒速与50→100rpm变速搅拌条件下，终细胞密度相近；而50rpm恒速条件下细胞扩增效果较优。10天培养周期结束时，葡萄糖浓度降至约2g/L，乳酸浓度升至约0.8g/L。细胞生长通常在此代谢水平下进入平.台期，与细胞密度变化趋势一致。
 

图3E-F.50×10³cells/mL的较低接种密度可实现较高的扩增倍数。10天培养结束时，50×10³cells/mL与100×10³cells/mL接种组的代谢谱特征相近。

三、PBS-3L中试：补料批培养可明显提升细胞产量
基于小试优化参数，研究将工艺放大至3L规模，并对比了批培养与补料批培养两种培养策略：

• 批培养模式：3L全体积起始培养，全程不补加培养基
• 补料批培养模式：2L起始培养，接种后第3天补加1L新鲜培养基至满体积

实验结果显示，补料批培养策略通过补充营养、稀释代谢废物，有效延缓了生长平.台期，总细胞产量优于批培养模式；同时0.1L小试与3L中试的细胞生长动力学、代谢趋势高度一致，验证了PBS垂直轮反应器的线性放大特性，工艺参数可直接迁移，大幅降低放大风险。

图4.细胞扩增结果分析图。该组图谱包含三部分内容：(A)非灌流培养批培养的细胞密度变化曲线；(B)经FLEX2代谢分析仪检测的葡萄糖、乳酸浓度变化（实线代表葡萄糖，虚线代表乳酸）；(C)三个培养批培养的细胞计数及扩增倍数统计。结果证实：相较于批培养模式，采用补料批培养换液策略可获得更高的细胞产量

代谢数据显示，当葡萄糖浓度降至约2.0g/L、乳酸浓度超过1.0g/L时，细胞生长开始进入平.台期，这一阈值也为后续灌流工艺的启动时机提供了参考依据。

四、ATF灌流工艺：扩增产量提升2.6倍
为进一步实现工艺强化，研究在3L反应器上搭配RepligenATF2系统，开发了灌流培养工艺，灌流速率设定为1.5L/天（0.5VVD）。

图5.灌流培养操作工艺图谱。(A)4号批培养（R4-DB-灌流）与5号批培养（R5-DB-灌流）的细胞密度变化曲线，图中标注各阶段灌流启动节点；(B)葡萄糖与乳酸代谢浓度变化曲线（实线代表葡萄糖，虚线代表乳酸）；(C)细胞收获总量、细胞扩增倍数对比；其中4号批培养接种密度为250cells/μL，5号批培养接种密度为300cells/μL；(D)灌流运行计划表（VVD：每日罐体工作体积换液量）。

1.扩增效率大幅提升
相较于同供体的补料批培养工艺，灌流模式下细胞扩增倍数提升2.6倍，较高活细胞密度达5×10⁶cells/mL，3L体系单批培养总活细胞量可达1.5×10⁹。

2.细胞质量无明显影响
通过凋亡检测验证，灌流启动前后细胞健康状态无明显差异，健康细胞占比稳定在60%以上，说明垂直轮温和的流体环境+ATF低剪切截留模式，不会对NK细胞造成额外损伤。

图6.5号灌流培养批次（R5-DB-Perfusion）细胞健康状态评估。对灌流启动前后的细胞健康状态进行检测对比，结果表明灌流启动前后细胞整体健康水平基本一致。

3.代谢环境更稳定
灌流可持续补充新鲜营养并移除乳酸等代谢废物，使培养体系的葡萄糖、乳酸浓度维持在稳定区间，避免了批培养培养中代谢废物积累导致的生长抑制。

研究同时指出，以细胞密度/代谢水平作为灌流启动依据，比固定天数启动更具经济性，可提升培养基利用效率。

五、功能验证：反应器扩增细胞杀伤效力更优
细胞扩增数量之外，功能活性是临床价值的核心。研究通过LDH杀伤实验，对比了PBS反应器与静态G-Rex培养体系扩增的CAR-NK细胞效力：

• 培养第7天：PBS组相对杀伤效力为G-Rex组的1.77倍
• 培养第8天：PBS组相对杀伤效力提升至G-Rex组的2.56倍

结果表明，垂直轮反应器的动态培养环境，不仅能提升细胞产量，还有助于维持甚至增强CAR-NK细胞的肿瘤杀伤功能。此外，扩增后的细胞CAR表达水平正常，经冻存复苏后活性符合要求，适配临床制备的全流程需求。

图7.静态G-Rex培养体系与5号灌流培养批次（R5-DB-Perfusion）的细胞相对效力（RP）对比。(A)接种后第7天，PBS-3反应器与G-Rex培养体系的细胞相对效力；(B)接种后第8天，PBS-3反应器与G-Rex培养体系的细胞相对效力。

图8.单一供体（供体B）来源CAR-NK细胞在垂直轮生物反应器（VWB）中的细胞密度变化。(A)PBS-3与PBS-0.1反应器的补料批培养结果显示，二者生长动力学特征一致，验证了工艺线性放大的一致性；(B)PBS-3反应器中补料批培养与灌流培养的对比表明，采用灌流换液策略可有效提升细胞产量。

六、总结与展望
本次研究系统验证了PBS垂直轮生物反应器在CAR-NK扩增中的可行性与优势：

1. 低剪切环境适配免疫细胞：温和的流体特性可维持高细胞活率与功能活性
2. 线性放大降低开发成本：0.1LMini模型的工艺参数可直接迁移至3L及更大规模
3. 灌流工艺强化产能：搭配ATF灌流后，细胞产量较补料批培养提升2.6倍
4. 满足临床级生产需求：按实验数据推算，80L规模灌流培养下，理论总细胞产量可达4×10¹¹，可满足多位患者的临床治疗剂量需求（参考文献中NK细胞疗法的治疗剂量通常为每公斤体重5×10⁶~1×10⁸个NK细胞）。

同时该白皮书也客观指出，目前的工艺尚未达到体系上限，通过进一步优化培养参数、采用基于实时代谢的反馈式灌流策略，细胞密度与产量还有进一步提升的空间。

整体而言，这套“垂直轮反应器+ATF灌流”的CAR-NK扩增工艺，为细胞治疗企业提供了一套可复制、可放大、合规性强的规模化生产解决方案。

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本文基于PBS Biotech与GeneFab联合发布的专项白皮书资料由其中国提供商上海曼博生物整理，用于科研信息分享、实验参考等。上海曼博生物可提供PBS Biotech PBS Mini、PBS-3等垂直轮生物反应器、0.1L与0.5L一次性耗材及CAR-NK临床级规模化扩增相关产品与技术支持。