在抗体药物发展的早期阶段，Protein A亲和层析的核心任务较为明确，即实现高效捕获并提高回收率。

随着双特异性抗体（bsAbs）、Fc融合蛋白等复杂分子形式的发展，下游纯化的关注重点正在变化。对于稳定性较低的复杂分子，Protein A不应仅作为“捕获蛋白”的步骤，还需关注以下问题：

• 能否提供更温和的洗脱环境，减少低pH诱发的聚集与降解？
• 能否在捕获阶段改善单体与聚集体的分离？
• 能否减轻后续精纯（Polishing）步骤的负担？

针对这些问题，Bestchrom（博格隆）与Altruist Biologics（夏尔巴生物）联合发布技术白皮书《Beyond Conventional Protein A: Mild Elution and Aggregate Control for Complex Antibody Purification》。

本文以一款工业级双特异性抗体为模型，介绍工程化Protein A在由产品捕获向产品质量调控拓展方面的表现。

挑战升级：复杂分子面临的不只是载量问题

Protein A是Fc类分子的经典捕获平台。但在处理双特异性抗体等复杂分子时，传统填料可能面临更多挑战。

复杂分子更易受到低pH环境影响，可能出现构象变化和聚集；在传统洗脱条件下，单体、聚集体和片段也可能发生共洗脱。文中模型的洗脱组分中，聚集体杂质比例接近10%，增加了后续离子交换或疏水层析的纯化负担。

因此，对于复杂抗体，Protein A的评价标准正由单一的捕获能力，扩展至温和洗脱和聚集体分离能力。

评估方向：提高洗脱pH与改善聚集体去除

在联合技术评估中，研究对比了传统填料AT Protein A Diamond Plus与两款工程化填料Novo-A Diamond和Extrem A Diamond。结果显示，工程化配基可能改善洗脱条件和聚集体控制表现。

优势一：较高洗脱pH下的温和洗脱

传统填料的洗脱峰顶pH为4.29，工程化填料的洗脱峰顶pH为4.87-5.00。对于低pH敏感的复杂抗体，较高的洗脱pH有助于降低降解和聚集风险，并扩大工艺开发的操作范围。

Figure 1. Elution pH, defined as the pH of UV peak maximum of bsAb on protein A resins.

优势二：聚集体降低率达66.93%

在相同双特异性抗体模型中，不同填料的聚集体控制效果存在差异。

Table 1. 博格隆下一代亲和填料在聚集体降低率上的表现

其中，Novo-A Diamond的聚集体去除能力为AT Protein A Diamond Plus的约7倍，单体纯度提高5个百分点以上。其单体收率较传统填料略低，约为85%-87%，但聚集体去除和纯度提升有助于减轻后续精纯步骤的负担。整体工艺收益仍需结合具体分子和工艺条件进行评估。

Figure 2. SEC-HPLC purity, Aggregate reduction percentage and monomer yield of main peak.

机制分析：差异化解离动力学

工程化填料改善聚集体分离的可能机制之一，是配基设计带来的差异化解离动力学（Differential Dissociation Kinetics）。

在洗脱曲线中，Novo-A Diamond形成了具有工艺价值的聚集体富集拖尾区域（肩峰）。目标单体较易解离，优先洗脱进入主峰；聚集体因存在多价Fc结合，解离较慢，更多滞留于尾峰。

这一特性为工艺人员提供了收集策略（Pool-cut）的调整空间：

• 需要较高纯度时，可截取主峰前段；
• 需要平衡收率时，可适当放宽收集窗口。

进阶评估：盐添加剂对分离效果的影响

在具备分离基础后，研究进一步考察了盐添加剂的影响。在流动相中添加50 mM NaCl或50 mM CaCl₂后，分离效果发生变化。

• 以Extrem A Diamond为例，未添加盐时单体纯度为92.61%；加入50 mM NaCl后，单体纯度升至95.79%，同时收率保持稳定。
• 对于Novo-A Diamond，CaCl₂的效果较NaCl更明显，可使主峰与聚集体峰的分离更加清晰。

盐离子可通过静电屏蔽和疏水作用调节，放大单体与聚集体之间的解离速率差异，使单体和聚集体表现出不同的洗脱行为。

更清晰的峰间拐点有助于优化目标产物的收集窗口：既可通过切除富含聚集体的尾峰提高纯度，也可适度放宽收集范围以平衡收率，为工业放大提供工艺调整空间。

Figure 3. Protein A affinity chromatograms for (A) Extrem A Diamond without salt, (B) Extrem A Diamond with 50 mM NaCl, (C) Novo-A Diamond without salt, (D) Novo-A Diamond with 50 mM NaCl, and (E) Novo-A Diamond with 50 mM CaCl₂. (F) Overlay of the chromatograms from (C) to (E).All runs were conducted using a linear pH gradient (pH 5.5–3.0, 20CV) with the specified additives in the mobile phase.

工业化评估：150次CIP循环后的稳定性

层析填料的耐用性是工业应用的重要评价指标。除温和洗脱外，Protein A填料还需经受商业化生产中的清洗和重复使用条件。

在经历150个循环、每循环采用0.5 M NaOH进行15分钟CIP后，Extrem A Diamond和Novo-A Diamond的DBC₁₀_%分别保持为初始值的89%和79%。

上述结果表明，两款填料在该测试条件下具有一定的多循环使用稳定性。

Figure 4. Alkaline stability of Extrem A Diamond, Novo-A Diamond and AT Protein A Diamond Plus

结语：捕获阶段的产品质量调控

Bestchrom与Altruist Biologics的联合研究显示，Protein A的功能定位可由单纯的捕获介质（Capture resin）延伸至产品质量调控平台（Product-quality shaping platform）。

温和洗脱，保护分子完整性

Novo-A Diamond与Extrem A Diamond通过工程化配基设计，将该双特异性抗体模型的洗脱峰顶pH提高至4.87-5.00，有助于降低低pH敏感分子的降解与聚集风险。

差异化解离动力学，实现捕获阶段的聚集体控制

Novo-A Diamond的聚集体降低率为66.93%，单体纯度为95.53%；在优化条件下，Extrem A Diamond的单体纯度可达95.79%。聚集体富集肩峰为收集策略提供了调控空间。

调整捕获工艺的设计思路

通过在捕获阶段去除部分聚集体，后续精纯步骤，如离子交换和疏水层析的杂质负担可能降低，并为下游工艺设计提供更多选择。

对于双特异性抗体、Fc融合蛋白或其他低pH敏感的复杂分子，工程化Protein A可作为兼顾分子完整性、纯度与稳定性的工艺评估方向之一。

【联合研究说明】

本文核心数据与观点基于Bestchrom与Altruist Biologics联合发布的英文白皮书整理。该研究结合了Bestchrom的工程化Protein A亲和层析技术平台，以及Altruist Biologics在复杂抗体下游工艺开发中的经验，评估了工程化Protein A在温和洗脱、聚集体控制和工艺窗口拓展方面的表现。