引言

PROTAC是一种异双功能分子，通过E3泛素连接酶将靶蛋白特异性泛素化，引导蛋白酶体降解，实现精准蛋白降解。相比传统小分子抑制剂，PROTAC可靶向“不可成药”靶点、作用持久且能克服耐药性。2026年5月，FDA批准了首款PROTAC药物Vepdegestrant（ARV-471）上市，用于治疗乳腺癌。这标志着PROTAC技术首次实现从概念到临床药物的完整转化。

高通量合成技术在药物研发中已成为不可或缺的工具，尤其是在利用384和1536孔板进行反应优化和直通生物学筛选（D2B Direct-to-Biology ，D2B）中展现出巨大潜力。针对PROTAC开发中连接子与E3配体组合优化的高成本与长周期，D2B策略从根本上改变了传统路径：初筛跳过纯化，将微孔板反应粗产物直接用于生物检测，仅阳性分子才进入重合成与验证。这一模式将单轮周期从数周压缩至数天，显著提升了迭代效率。

本文主要介绍GSK团队联合Strathclyde大学，建立了一套超高通量PROTAC合成和筛选平台，在1536孔板中以5 μL反应体积进行纳摩尔级的酰胺偶联反应，并将反应粗产物直接用于HiBiT细胞降解活性检测。mosquito纳升级液体工作站在这场技术革新中扮演了至关重要的角色，其通过构建精准、微量的1536孔板反应体系，为整个超高通量合成与筛选平台的建立提供了坚实的技术基石。该研究成果发表在药物化学领域顶级期刊之一的Journal of Medicinal Chemistry。

实验结果

图1展示了GSK从PROTAC分子的合成到生物学评价的完整D2B工作流程。流程起始于起始物料储备液的准备，随后通过mosquito纳升级工作站，将试剂分配至1536孔反应板中进行纳摩尔级酰胺偶联反应。反应完成后，利用mosquito取0.5 μL反应混合物384孔板进行LC-MS分析，并通过PyParse软件自动处理数据，判定反应成功与否及粗产物纯度。成功的反应混合物不经任何纯化，直接和细胞孵育过夜，随后进行HiBiT降解活性检测和CellTiter-Glo细胞活力检测获得细胞水平的靶点降解数据。

图1：从PROTAC分子的合成到生物学评价的完整D2B工作流程

图2 对比了不同酰胺偶联试剂（HATU和EDC）条件下合成的PROTAC及其相应反应粗产物在HiBiT降解实验和CTG细胞活力实验中的表现。Panel A显示，HATU和EDC条件下合成的化合物1和3均展现出与纯品对照相似的HER2降解曲线，表明两种偶联试剂均能有效生成具有生物活性的PROTAC。Panel B则显示了关键区别：HATU反应粗产物在高浓度下表现出明显的细胞活力下降（细胞毒性），而EDC反应粗产物无此效应，与纯品对照一致。该差异提示HATU试剂或副产物对细胞检测体系存在干扰，可能导致假阳性降解结果。

图2：PROTACT粗提物在细胞HiBit和CTG实验中的表现

图3 D2B合成的阳性对照PROTAC（化合物1）展现出与纯品一致的降解曲线，而阴性对照（化合物2）无降解活性，证明了粗品D2B策略的可行性。但D2B阳性对照在较高浓度下呈现出更明显的hook效应，可能源于反应粗品中残留的过量配体在高浓度下竞争性结合靶蛋白。同时，细胞活力检测显示D2B粗品与纯化样品的细胞毒性曲线高度一致，确认了残留试剂对细胞读数无干扰。通过对58个HER2 PROTAC库的D2B筛选，成功鉴定出4个具有明确剂量-响应降解活性的新型化合物——5.2、5.7、6.2、6.7。

图3：筛选获得4个novel的HER2 PROTACT分子

图4 对650个BRD4 PROTAC的HiBiT筛选结果进行了系统分析，大部分化合物表现出高效降解活性，大批化合物达到纳摩尔甚至皮摩尔级别的DC50值。部分活性最强的化合物（pDC50 > 10.77）在最高浓度下伴随着细胞活力下降，这被解释为BRD4蛋白被完全耗尽后对细胞存活产生的直接影响。该筛选成功鉴定出多个皮摩尔级BRD4降解剂，其中部分化合物属于迄今为止文献报道的最强效BRD4降解剂之列。

图4：650个BRD4 PROTAC库的筛选和分析

总结

该文章建立了一套超高通量（Direct-to-Biology，D2B）PROTAC实验平台，核心流程如下：

1.  纳摩尔级合成：在1536孔板中以5 μL反应体积进行酰胺偶联反应，试剂用量仅150 nmol。

2. 条件优化：系统筛选偶联试剂、碱、添加剂，确定EDC/NMM/OxymaPure为最优组合，兼顾高转化率与低细胞毒性，适用于多种胺底物。

3. 粗品直接检测：跳过纯化步骤，将反应粗产物直接用于HiBiT和CTG细胞降解活性检测，仅阳性分子后续重合成与确证。

4. 自动化与数据分析：采用mosquito完成纳升量级1536孔板反应体系的构建以及384孔板的化合物梯度稀释；借助PyParse实现LC-MS数据的自动化分析与纯度判定。

回顾和展望

mosquito是SPT Labtech自2001年成立以来最早研发的经典产品之一，至今已有超过 25 年历史，服务全球 2000 多家用户（其中国内用户超过 200 家）。mosquito 诞生的初衷，是为了解决结构生物学家在蛋白晶体筛选中的关键瓶颈：在兼容高粘度蛋白与结晶试剂的同时，实现极微量反应体系（低至 25~50 nL）中样品的精准添加与转移，从而节省珍贵的蛋白样品。随着高通量药物筛选、单细胞测序、蛋白组学和合成生物学的蓬勃发展，mosquito 的应用场景进一步拓展，并在这些前沿领域中发挥着日益重要的作用。

过去的五年间，D2B（Direct-to-Biology，直接生物筛选）技术已从概念验证阶段，逐步发展为高通量药物发现领域的核心能力模块，在GSK、勃林格殷格翰、阿斯利康等跨国药企，以及众多国内大型CRO企业中实现了标准化落地。在此浪潮中，mosquito 正积极把握机遇，力求在超微量高通量自动化合成和筛选这一关键环节中，扮演更为重要的角色。

更多mosquito应用于高通量纳摩尔化药物化学合成的文献

1. Buitrago Santanilla A, Regalado EL, Pereira T, et al. Organic chemistry. Nanomole-scale high-throughput chemistry for the synthesis of complex molecules. Science. 2015; 347 (6217): 49-53.

2. Lin S, Dikler S, Blincoe WD, et al. Mapping the dark space of chemical reactions with extended nanomole synthesis and MALDI-TOF MS. Science. 2018; 361 (6402): eaar6236.

3. Pomberger, A, Pedrina McCarthy, A. A, Khan, A, et al. The Effect of Chemical Representation on Active Machine Learning Towards Closed-Loop Optimization. React. Chem. Eng. 2022, 7, 1368,

4. Gesmundo, N., Dykstra, K., Douthwaite, J.L. et al. Miniaturization of popular reactions from the medicinal chemists’ toolbox for ultrahigh-throughput experimentation. Nat. Synth 2. 2023, 1082–1091.

5. Mahjour B, Zhang R, Shen Y, et al. Rapid planning and analysis of high-throughput experiment arrays for reaction discovery. Nat Commun. 2023; 14 (1): 3924

6. Stevens R, Bendito-Moll E, Battersby DJ, et al. Integrated Direct-to-Biology Platform for the Nanoscale Synthesis and Biological Evaluation of PROTACs. J Med Chem. 2023;66(22):15437-15452.

7. Rebecca S, Glenn A. Burley, et al. Factors to Consider for Synthesis in 1536-Well Plates An Amide Coupling Case Study for PROTAC Synthesis. Journal of Organic Chemistry (2025) 90 (6): 2192–2200.