01、蛋白相互作用
蛋白相互作用是细胞生命活动的分子机制基础，信号传导、代谢调控、免疫应答等生理过程均依靠蛋白之间的结合、激活与抑制共同完成。蛋白相互作用在细胞生物学研究、药物研发与靶点筛选、疾病的发病机制研究等领域，从整体层面解析细胞生命活动的调控规律。而如何原位、空间定位、可重复地定量蛋白真实相互作用，一直是功能蛋白质组研究的一大技术难题。
 
02、蛋白相互作用的传统技术和局限
传统制备蛋白相互作用图谱的主流技术是免疫共沉淀技术和质谱分析技术，这两种方式均需从组织或细胞裂解液中提取蛋白混合体系，能够验证蛋白之间存在的结合关系，但无法定位蛋白互作发生的位置，丢失了空间位置与细胞层面的信息，也难以捕捉病理状态下蛋白互作强度的细微变化。
 
来自比利时根特大学佛兰德斯生物技术研究所（VIB）生物成像中心的Eef Parthoens，同样表示：“利用裂解液的免疫共沉淀或质谱实验，研究蛋白间相互作用，仅能得到整体平均后的结论。需借助显微成像技术，进一步探究该互作发生在组织哪个区域、哪类细胞、哪个亚细胞结构中。” 因此，多重免疫荧光技术也广泛用于解析蛋白相互作用图谱。基于显微成像实现蛋白共定位观察，一定程度上保留了空间位置信息。通过荧光信号重叠代表两个蛋白在微米尺度上位置靠近，然而荧光强度会受荧光基团浓度、光照不均、染色效率、组织厚度以及光漂白效应等多种因素影响。所以，无法确定二者发生分子层面结合，极易产生假阳性结果，较难进行互作强弱的真实定量，给机制解析、靶点验证、药效评估带来困扰。
 
针对传统手段的如上痛点，HAWK biosystems开发了QF-Pro®技术，不仅能明确“蛋白之间是否存在互作”，还能精准标注互作发生的组织区域、细胞类型、亚细胞结构，同时量化互作强弱变化，具有分辨率高、定量精准、数据重复性好等特点，适配复杂组织、高自发荧光干扰、需精准量化差异的应用场景。
 
03、QF-Pro®技术原理- 实现 10 nm 级原位蛋白互作定量
QF-Pro®用增强型荧光共振能量转移（FRET）联合简化频域荧光寿命成像（FLIM），在蛋白相互作用功能分析的分辨率为10nm（图1）。即两种特定荧光基团靠得足够近（10nm以内）时出现FRET现象，导致荧光寿命缩短，荧光寿命的变化被FLIM收集，从而精确验证目的标志物是否存在真实的相互作用。因此，HAWK的高分辨率，有效避免了常规多重荧光及其他技术单纯的空间重叠但无相互作用的假阳性信号问题；同时，荧光寿命缩短是荧光分子的内在属性，不受浓度、酸碱度等外界条件影响，HAWK的精准定量分析更稳定、更准确。  
Eef Parthoens坦言：“荧光寿命是物质的固有物理属性，检测的不是信号强弱而是荧光基团本身的发光特征。FLIM 操作较复杂，还需要专业的实验设计和操作经验，才能获得可重复的检测结果，即使我们已有Leica STELLARIS 的Falcon寿命检测平台，也无法确保规模化样本的高稳定性和高重复性结果。”
 
04、HAWK 应用实例：脓毒血症小鼠模型研究
在比利时根特大学佛兰德斯生物技术研究所（VIB）的脓毒血症小鼠模型肝组织研究中，同时采用传统免疫荧光与 HAWK QFPro® 平台开展对比分析。
 
该研究针对健康小鼠与腹腔脓毒血症小鼠的肝组织，一部分样本制成单细胞悬液，用于传统免疫荧光法检测；另一部分样本制成组织切片，用于HAWK空间蛋白功能分析，检测健康小鼠与脓毒血症小鼠肝组织切片中蛋白互作信号。
 
传统免疫荧光检测仅能观察到蛋白共定位现象，即证实两种蛋白存在共定位，无法分辨健康与脓毒血症病理样本之间蛋白结合强度的细微差异，难以深入机制研究。
 
HAWK QF-Pro®增强型FLIM-FRET体系检测后，研究团队直接获取到两组肝组织样本中荧光寿命定量化的差异，成功捕获病理诱导下蛋白互作的动态强弱改变，发现了传统荧光技术无法观测的生物学信号，为脓毒血症肝损伤机制研究提供了原位定量证据（图2）。该研究成果已在瑞典斯德哥尔摩聚焦显微技术大会公开展示，获得领域内广泛认可。  
该案例可充分证明QF-Pro®并非传统染色技术的简单替代，而是空间原位蛋白互作定量研究的专用工具，把研究从 “蛋白表达高低” 推进到 “蛋白是否真正结合、互作强度如何、发生在什么位置”。
 
原文链接：https://blog.vib.be/seeing-interactions-where-biology-happens
 
厂商介绍：HAWK Biosystems
HAWK Biosystems位于西班牙，成立于2016年，聚焦空间功能蛋白质组学领域研究。
 
HAWK 超高精度原位蛋白相互作用定量分析系统
* 核心技术 QF-Pro®，FRET/FLIM（荧光共振能量转移 / 荧光寿命成像显微镜）；
* 10 nm 高分辨率，原位量化蛋白相互作用的功能空间图谱，突破仅能检测蛋白表达／共定位的局限；
* 特有的信号放大机制有效克服自发荧光，有效提升信噪比；
* 用于蛋白质相互作用、蛋白翻译后修饰、肿瘤治疗有效性评估、肿瘤微环境信号解析、靶标靶点等定量分析和验证。
 
环亚生物科技有限公司
环亚生物科技有限公司（APG BIO）是HAWK Biosystems 在中国地区的独家代理商，为国内研究者提供HAWK原位蛋白相互作用定量分析系统及服务的推广、销售、应用培训及售后保障等一站式服务。