【概要】

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莱克多巴胺（Ractopamine，缩写RAC）是一种结构和功能类似肾上腺素和去甲肾上腺素的苯乙醇胺类β2-肾上腺素受体激动剂，由于其生产成本低廉，又具有营养再分配作用，可明显提高瘦肉率，作为一种新型促生长添加剂在畜产品生产中使用，尤其是当“瘦肉精”克伦特罗全面禁止使用后，莱克多巴胺便成为畜产品生产中兽药添加剂的首选。当人类食用含有该残留的畜产品会引发食物中毒，对患有高血压、青光眼、糖尿病、前列腺肥大等疾病的患者危害更大，严重的可能危及生命。国际上一些国家都将其列为违禁药物，我国国家卫生部、农业部、药品监督管理局发布的《禁止在饲料和动物饮用水中使用的药物品种目录》公告中明确禁止莱克多巴胺在食用动物中使用。因此，有必要对其进行有效的监控。HPLC或GC-MS一直用作检测β-兴奋剂的方法，但是其前处理步骤繁琐，费用昂贵。酶联免疫检测试剂盒则可经济、快速地检测莱克多巴胺。

【适用范围及检测限】

可快速定性、定量检测尿样、肝脏肌肉组织等和饲料等样本中的莱克多巴胺。

检测限为：0.1ppb

【试验原理】

本试剂盒采用竞争ELISA，在微孔板上预包被莱克多巴胺抗原，加入样本（或莱克多巴胺标准品溶液）及辣根过氧化物酶标记的莱克多巴胺抗体。样本或标准品溶液中的莱克多巴胺与预包被在板孔上的莱克多巴胺抗原竞争结合辣根过氧化物酶标记的莱克多巴胺抗体。与样本或标准品溶液中的莱克多巴胺结合的酶标抗体在洗涤时被除去。再加入TMB显色液，读取吸光值。样本的吸光值与其所含残留物莱克多巴胺抗原的含量成负相关。对照标准曲线，即可得出相应残留物莱克多巴胺的含量。

【试剂盒组成】

1.      96孔酶标板×1块

2.      标准液×6瓶：（1ml/瓶）

  0ppb, 0.1ppb, 0.3ppb, 0.6ppb, 1.2ppb, 3.6ppb

3.      酶标物 1瓶  …………………………………………… 6ml

4.      显色液1瓶    ………………………………………  12ml

5.      终止液      ………………………………………6ml

6.      浓缩洗涤液 （10×） ………………………………… 40ml

7.      浓缩样品稀释液（2×） ……………………………… 40ml

【需要而未提供的设备及试剂】

设备：

┅┅微孔板酶标仪450nm/630nm

┅┅振荡器

┅┅涡旋仪

┅┅离心机

┅┅天平：感量0.01g

┅┅微量移液器：单道 20μl～200μl、200μl～1000μl

多道 250μl

┅┅滤纸

试剂：

┅┅乙酸乙酯

┅┅乙腈

┅┅正己烷

┅┅去离子水

【试剂配制】

1.      样品稀释液：用去离子水将浓缩样品稀释液按1:1体积比进行稀释（1份浓缩样品稀释液+1份去离子水）。

2.      洗涤工作液：用去离子水将浓缩洗涤液按1:9体积比进行稀释

【样本前处理步骤】

（一）尿样处理方法（稀释倍数1）

┅┅取1.0ml尿样加入6.0ml乙酸乙酯；

┅┅强力振荡3分钟；

┅┅5000rpm离心10min或用滤纸过滤；

┅┅取3.0ml上清液或滤液用氮气吹干或60度蒸干乙酸乙酯，加入0.5ml已稀释的样品稀释液，混合均匀；

┅┅取稀释后液体待测。

（二）组织器官（肌肉、肝脏）样本处理方法（稀释倍数1）

┅┅取3.0g组织器官，加入9.0ml乙腈, 混匀10min；

┅┅5000rpm15℃离心10分钟，取上清3.0ml到另一离心管，在60℃下用氮气吹干；

┅┅加入1.0ml正己烷，振荡30秒，加入1.0ml已稀释的样本稀释液，混合均匀；

┅┅5000rpm 15℃离心10分钟；

┅┅取稀释后液体待测。

（三）饲料处理方法（稀释倍数1）

┅┅用研钵研碎饲料，称1.5g研碎的饲料样品加入8.0ml 乙腈和1.0ml 乙酸乙酯，充分混合5分钟；

┅┅室温下4000g离心10分钟，取上清6.0ml到另一离心管，在60℃下用氮气吹干；

┅┅加入1.0ml正己烷，振荡30秒，加入1.0ml已稀释的样本稀释液，充分混合1分钟；

┅┅4000g离心10分钟，转移出下层液体。（如下层液体仍然浑浊可提高转速或用滤纸过滤）；

┅┅取稀释后液体待测。

【检测步骤】

1.    测定前须知：

1.      使用之前将所有试剂和需用板条的温度回升至室温（20～25℃）。

2.      使用之后立即将所有试剂放回2～8℃。

3.      在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是ELISA测定程序中的要点。

4.      在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖板膜封住微孔板。

2.    操作步骤：

1.      将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温（20～25℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。

2.      取出需要数量的微孔板，将不用的微孔板放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封，保存于2～8℃。不要冷冻。

3.      洗涤工作液在使用前也需回温。

4.      将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。

5.      加标准品/样本50μl到对应的微孔中,加入酶标物50μl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温避光环境中反应15min。

6.      小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液300μl/孔，充分洗涤5次，每次间隔30s，用吸水纸拍干。

7.      加入显色液100μl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温避光环境反应15min。

8.      加入终止液50μl/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处测定每孔OD值。

【结果判定】

（1）百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均值（双孔）除以第一个标准（0标准）的吸光度值，再乘以100%，即

B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

B0—0(ppb)标准溶液的平均吸光度值

（2）标准曲线的绘制与计算

以标准品百分吸光率为纵坐标，以莱克多巴胺标准品浓度（ppb）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中莱克多巴胺实际量。