DC细胞培养试剂盒

★ 产品描述

DC细胞培养试剂盒是百恩维生物根据DC细胞生长以及诱导需要开发的一个产品组合，可用于DC细胞临床治疗研究，生产过程符合cGMP的标准规范。

★ 产品货号

BW12012

★ 产品内容

★ 操作步骤

培养过程： 

以下过程作为常规免疫细胞培养的一般准则，如需在生物反应器或培养袋中高密度培养，应优化条件来确定最佳的操作步骤。 

T细胞培养：

1、准备新鲜的外周血单个核细胞（PBMC），或根据标准的外周血单个核细胞解冻程序，在37°C的水浴，快速解冻（〈1分钟）冻存的外周血单个核细胞。

2、用生理盐水洗涤细胞，根据需要也可加入2-5％热灭活的的人自体血浆。

3、用电子（即Coulter计数器，VI-细胞）或手动的方法（即血球计数仪）给细胞计数。

4、离心细胞，清除洗涤缓冲液。

5、培养初期，用含细胞因子（如IL-2）的培养基重悬PBMC，CD3 + T细胞密度保持在大约0.5-1×106/ml，转移细胞到相应的细胞培养容器（培养袋、培养瓶）。随后可应用各种操作激活T细胞，包括添加刺激的抗体或抗原呈递细胞。无论培养T细胞的规模大小，细胞均可被隔离，激活和扩大。

6、在37℃，5％CO2的潮湿培养箱中培养细胞，给予并维持细胞在对数期生长所需要的营养。为了保持细胞在对数期的增长，当细胞密度超过1×106/ml时，需要分离传代，维持细胞密度在0.5-1×106/ml（例如，2×106个细胞/ml以上，按1：4比例0.5x106细胞/ml）。在静态平板培养中为了获得最佳的气体交换，建议培养基深度不超过1到1.2厘米。

单核细胞树突状细胞培养： 

1、准备新鲜的外周血单个核细胞（PBMC）。 

2、将外周血单个核细胞铺在培养瓶中，加入适量免疫细胞无动物源培养基（货号BW12002）。 

3、在37℃，5% CO2的恒温培养箱中孵育2〜3小时。 

4、弃掉含非贴壁细胞的培养基。 

5、用生理盐水洗涤贴壁细胞（主要是CD14 +单核细胞）三次。 

6、添加重组人IL-4和重组人GM-CSF到免疫细胞无动物源培养基， 至终浓度分别为50～100 ng/ml和50 ng/ml，并以此培养基培养贴壁细胞。保持细胞密度在1～3x105细胞/cm2之间。研究者可视情况加入灭活的人自体血浆。

7、在37℃，5% CO2的潮湿培养箱中连续孵育5天，建议培养3天左右已添加了IL-4和GM-CSF的免疫细胞无动物源培养基换液，换液过程保留贴壁和不贴壁的所有细胞。

8、培养6天之后，细胞表现出典型的树突状细胞的形态和表面标记（细胞CD1a，CD80，CD86，HLA-DR）。 

9、向培养基中添加1ng/ml的LPS或者50ng/ml的TNF-α诱导的树突状细胞的成熟。

DC细胞培养方案：

1、采集健康人外周血，肝素抗凝，以Ficoll Hypaque淋巴细胞分离液分离获得单个核细胞(MNC)。

2、用免疫细胞无动物源培养基（Biowit Technologies）漂洗3次，调节细胞密度为1×106cells/mL。

3、放置37℃，5% CO2孵育箱中贴壁培养2-3h，倒掉未贴壁的细胞和培养基，用用免疫细胞无动物源培养基（Biowit Technologies）轻微漂洗贴壁的细胞3次，加入适量的免疫细胞无动物源培养基（Biowit Technologies），建议细胞密度为1-3×105cells/mL。

4、加入rhIL4（终浓度为20ng/ml）和rhGM-CSF（终浓度为50ng/ml）到此培养基中，放置37℃，5% CO2孵育箱中继续培养5天。

5、建议3天后更换含有rhIL4（终浓度为20ng/ml）和rhGM-CSF（终浓度为50ng/ml）的免疫细胞无动物源培养基（Biowit Technologies）。

6、在培养至第6天加入rhTNFα（终浓度为50ng/ml）到此培养基中。

7、一般来说在细胞培养至7-9天左右时，即诱导成为DC细胞。