NAD
氧化型辅酶Ⅰ
产品编号规 格价 格
N8110-250 250mg 100.00
N8110-1000 1g 290.00
氧化型辅酶Ⅰ通常用于生化研究；药物研究，临床诊断；有机合成。
其它名称也叫β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；二磷酸吡啶核苷酸；
Diphosphopyridine nucleotide；C oenzymeⅠ；CoⅠ；NAD； NAD+；
分子式：C21H27N7O14P2 分子量：663.43
53-84-9是氧化型辅酶Ⅰ的CAS号
外观：白色冻干粉
特性：pH：约3.0(水)
溶解性：溶于水，参考浓度10mg/ml，不溶于丙酮等有机溶剂
储存条件：2-8℃ From Roche

性状(以下信息仅供参考)：白色或淡黄色粉末。
氧化型辅酶Ⅰ极易吸湿。固体在干燥器内0℃或室温时稳定。中性或微酸性溶液（pH3～7)，在0℃时可稳定2周以上，碱性溶液中极易变质，加热易分解。
2～8℃储存氧化型辅酶Ⅰ
溶解性：溶于水，不溶于丙酮等有机溶剂
用途：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸是一种转递質子（更准确来说是氢离子）的辅酶，它出现在细胞很多代谢反应中。

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辅酶ⅠNAD(H)含量试剂盒说明书

产品简介：

辅酶ⅠNAD(H)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，NAD是糖酵解和TCA循环的主要氢受体，生成的NADH经呼吸电子链传递把电子交给氧，在合成ATP的同时，形成大量的ROS，同时NADH再生为NAD。糖、脂、蛋白质三大代谢物质分解中的氧化反应绝大部分通过这一体系完成。NAD(H)含量和NADH/NAD比值的高低可用于评价糖酵解和TCA循环的强弱。较高的NAD(H)及NADH/NAD比值说明细胞呼吸耗氧量较高，处于过氧化状态，NADH/NAD比值升高也可抑制糖酵解和TCA循环。另外，NAD降解产物具有非常重要的调控作用。

NAD和NADH在254 nm下有吸收峰，利用高效液相色谱法在相应波长下测定其含量。

试验中所需的仪器和试剂：

高效液相色谱仪、低速离心机、溶剂抽滤装置、针头式过滤器（水系，50个，0.22μm）、滤膜（水系和有机系各2个，0.45μm）、C18柱（4.6 ×150 mm）、可调式移液器、样品瓶（50个，2mL）、乙腈（120 mL）、甲醇（色谱级，300 mL）、蒸馏水 

注：若用自动进样器，需要样品瓶，测定时将不少于1mL的样品或标准品加入样品瓶中。无自动进样器，需手动进样时，不需要样品瓶，用进样针将不少于20ul的样品或标准品打入进样阀。

产品内容：

试剂一：粉剂1×1瓶，粉剂2×1瓶，4℃保存；临用前用少量蒸馏水将粉剂1和粉剂2溶解后倒入容量瓶中，用蒸馏水定容至100ml，形成NAD和NADH提取液（注：试剂瓶中的粉剂要冲洗干净），4℃保存3个月； 

试剂二：粉剂1×1瓶，粉剂2×1瓶，粉剂3×1瓶，4℃保存；临用前用少量蒸馏水将粉剂1、粉剂2和粉剂3溶解后倒入容量瓶中，用蒸馏水定容至1000ml，形成流动相缓冲液基质（注：试剂瓶中的粉剂要冲洗干净）, 4℃保存3个月。 

试剂三：NAD标准品5mg×1支，-20℃保存。加入1mL试剂一，配成5mg/ml 溶液，现配现用，用不完的试剂-20℃保存。 

试剂四：NADH标准品5 mg×1支，-20℃保存。加入1mL试剂一，配成5mg/ml 溶液，现配现用，用不完的试剂-20℃保存。

操作步骤：

一、实验前的准备工作：   

• 将双蒸水1000 ml、流动相缓冲液基质1000 ml、甲醇300 ml和乙腈120 ml用0.45μm的滤膜抽滤，以除去溶剂中的杂质，防止堵塞色谱柱。（注：双蒸水和缓冲液基质用水系滤膜抽滤，乙腈用有机系滤膜抽滤）。 
• 流动相的配制：将抽滤完毕的流动相缓冲液基质1000 ml与乙腈配比为9：1（v/v），即取900ml缓冲液基质与100 ml乙腈混合。[每个样品需要约12ml流动相，流动相用量（ml）=12ml×样品数量+跑基线用量（约50ml），流动相的用量请根据样品数量用多少配多少]。 
• 将抽滤完毕的甲醇和双蒸水配比成100%的甲醇，10%的甲醇，双蒸水各250 ml。 
• 将2和3中的溶剂超声30分钟，以脱去溶剂中的气泡，防止堵塞色谱柱。

二、辅酶ⅠNAD(H)的提取：

组织的处理：准确称取0.1g组织，加入1ml试剂一，提取NAD和NADH，匀浆。20000g，4℃离心30 min，取上清液用0.22μm水系针头式过滤器过滤后待测。可同时测定组织蛋白含量。

细胞处理：收集于60 ml细胞，离心菌体经高压冷冻干燥12 h后，加入2 ml试剂一。超声破壁细胞(950 W，30%，15 min，工作1 s，间隔2 s)，再经10,000g  4℃离心40min，上清用0.22μm水系微孔滤膜过滤后直接上柱检测。

三、辅酶ⅠNAD(H)含量测定操作步骤：

• 开启电脑、检测器和泵，安装上色谱柱，打开empower软件，在方法组中设置进样量20 μl，流速0.8 ml/min，保留时间15min，检测波长254nm，设置完毕保存方法组。 
• 用100%的甲醇、10%的甲醇、双蒸水按甲醇浓度从大到小的顺序洗色谱柱30min。 
• 用流动相洗柱子，待基线稳定后开始加样。 
• 加入标准品20 μl，在15min内可分离NAD和NADH，NAD的保留时间在3min左右，NADH的保留时间在7min左右（柱子不同，保留时间有差异），计算不同浓度的NAD和NADH标准品的峰面积。 
• 加入样品20 μl，在相应保留时间处检测NAD和NADH的峰面积。 

辅酶ⅠNAD(H)含量的计算：

1.  NAD含量的计算 

NAD标准曲线的绘制： 

将5mg/ml的NAD标准品用双蒸水分别稀释成110 μg/ml、80 μg/ml、50 μg /ml、和20 μg /ml 的NAD标准品溶液，计算不同标准品溶液的峰面积。 

计算标准曲线公式为:   y = 25069χ- 26754（χ为NAD浓度，μg/ml；y为峰面积） 

推出：χ=（y + 26754）÷25069（χ为NAD浓度，μg/ml；y为峰面积） 

NAD含量（μg/mg prot）=（样品峰面积+26754）÷25069÷蛋白浓度（mg/ml） 

NAD含量（μg/g mass）=（样品峰面积+26754）÷25069÷样本鲜重（g/ml）

2.  NADH含量的计算 

NADH标准曲线的绘制： 

将5mg/ml的NADH标准品用双蒸水分别稀释成200 μg/ml、150 μg/ml、100 μg/ml和50 μg/ml的NADH标准品溶液，计算不同标准品溶液的峰面积。 

计算标准曲线公式为:  y = 13275χ+35717（χ为NADH浓度，μ g/ml；y为峰面积） 

推出：χ=（y – 35717）÷13275（χ为NADH浓度，μ g/ml；y为峰面积） 

NADH含量（μg/mg prot）=（样品峰面积 - 35717）÷13275÷蛋白浓度（mg/ml） 

NADH含量（μg/g 鲜重）=（样品峰面积 - 35717）÷13275÷样本鲜重（g/ml）

注：标准品的稀释倍数要根据样品中NAD和NADH浓度确定，样品中NAD和NADH的峰面积必须落在不同浓度的NAD和NADH标准品的峰面积之内，该标准曲线紧供参考。