产品组分

注：溶液PE初次使用前用无水乙醇按1: 4稀释，即含80%乙醇。

溶液BD中含有变性剂，请不要直接接触皮肤。

上述产品组分均可单独购买，详见产品索引。

保存条件

室温保存2年。

产品说明

本产品采用了经典的硅胶膜技术，用于从TAE或TBE琼脂糖凝胶中回收DNA片段（50 bp-40 kb）。其纯化原理是含有目的片段的琼脂糖凝胶溶解后，硅胶膜柱高效可逆地吸附体系中的DNA片段（高盐、低pH值），蛋白及其它杂质不被吸附而被除去，被吸附的DNA片段在低盐、高pH值条件下再被洗脱纯化。一次可回收30 μg高纯度DNA片段，此DNA片段可直接用于各种酶促反应等。

产品特点

• 回收片段范围广：50 bp-40 kb。
• 高效：回收率大于85%。
• 高纯度：OD₂₆₀/OD₂₈₀=1.8-2.0。无须再酚/氯仿抽提纯化，可直接使用。
• 快速：15min完成实验。

产品用途

• 常规限制性酶切
• PCR扩增
• 转化
• DNA序列测定
• 体外转录

质量控制

从1 % TAE琼脂糖凝胶中纯化50 bp、1,000 bp、10,000 bp的DNA片段。

DNA凝胶回收流程图

图1  DNA凝胶回收流程图

操作方法

1  切取含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶条带。

   注：尽量切除不含有目的DNA部分的凝胶，减少凝胶体积，提高DNA回收率。

   切胶时，请使用长波长UV（360 nm）光盒。且不要将DNA长时间暴露在紫外灯下，以防DNA损伤。

2  称取凝胶的重量近似地确定其体积。

   注：凝胶重量的称量方法：取1.5 ml离心管电子天平称初质量，切胶装在离心管后称终质量，两者差即为胶的质量。不同厂家离心管的重量可能有差异，因此，每个离心管

的重量需单独称量。

3  按照每100 mg琼脂糖凝胶对应100 µl溶液BD的比例，向离心管中加入溶液BD。

4  55℃-65℃水浴7-10min，直至凝胶完全溶化。期间需要振荡混合3次。

   注：琼脂糖必须完全融化，以免堵塞柱子，严重影响DNA片段的回收效率。

    如果总体积大于500 µl，可适当增加溶胶时间。

    若此时溶液变红，可加10 µl 3M NaAC（pH 5.2）。

5  将步骤4所获溶液置于DNA纯化柱中，静置2min。

   注：胶块完全溶解后最好将胶溶液温度降至室温再上柱，因为纯化柱在较高温度时结合DNA 的能力较弱。

6  12,000 rpm离心1min。若溶液量大于DNA纯化柱的容积，可分两次离心，弃滤液。

   注：此时DNA片段被吸附于DNA纯化柱中的硅胶膜上。

7  加入500 µl溶液PE。12,000 rpm, 离心1min，弃滤液。

   注：溶液PE初次使用前用无水乙醇按1: 4稀释，即含80%乙醇。

   此步骤的作用是将硅胶膜上吸附的蛋白、盐等杂质洗脱，以获得高质量DNA片段。

8  加入500 µl溶液PE。12,000 rpm, 离心1min，弃滤液。

9  12,000 rpm离心 3min，以彻底去除纯化柱中的液体。

   注：此步骤的作用是去除残留乙醇，避免残留乙醇影响后续酶促反应。同时也利于DNA片段的充分溶解。

10 将离心柱置于新的1.5 ml离心管中。向纯化柱的中央处，悬空滴加30-100 µl溶液Eluent（60℃预热），静置2min。12,000 rpm 离心1min，管底即为目的DNA

片段。贮存于-20℃。

   注：溶液Eluent可用无菌双蒸水代替，但其pH需为8.0-8.5，加入体积视DNA目的片段的多少、用户对目的片段浓度要求而定。

   对溶液Eluent 60℃预热，会提高提取DNA目的片段的产量。

图2  切胶回收DNA片段电泳图

说明：使用5μg DL5000进行1%琼脂糖电泳。切出各条DNA片段后，使用本试剂盒逐一回收DNA片段。其结果如图2所示，所获DNA片段纯度高，回收率大于

70%。

注意事项

1  电泳时请使用新鲜配制的TAE或TBE电泳缓冲液，以免影响电泳及回收效果。

2  本试剂盒纯化柱的DNA吸附能力强。如果DNA浓度小，或DNA初始量少，回收率将会偏低。

DNA 浓度及纯度检测

1  回收得到的DNA 片段可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。DNA 应在OD₂₆₀ 处有显著吸收峰， OD₂₆₀ 值为1 相当于大约50 μg/ml 双链DNA、40 μg/ml 单链

DNA。

2  OD₂₆₀/OD₂₈₀ 比值应为1.7–1.9，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用去离子水，比值会偏低，因为pH 值和离子存在会影响光吸收值，但并不表示纯度低。

3  所有离心步骤均为使用常规台式离心机室温下进行离心，速度为12,000 rpm（约13,400×g）。

4 溶液 Eluent（10 mM Tris-HCl, pH 8.5）中不含EDTA，其收集的DNA片段可直接用于各种酶促反应等，不会影响后续试验。