Luc-Pair™ miR Luciferase Assay

应用报告基因研究转录后调控是细胞生物学研究和药物发现领域的常用方法。早前，研究者着眼于研究转录水平的启动子调节的活性。但是，现在转录后水平的调控被认为是细胞中另外一种重要的调控方式，例如：小分子RNA的干扰作用。小分子RNA中的代表：siRNA和miRNA被证实其在细胞翻译后水平有着广泛的调控作用。

荧光素酶基因是最广泛的基因表达功能研究中的报告基因，它具有如下优点：

• 灵敏度高，检测幅度宽
• 不是哺乳动物细胞内源性基因
• 重复性好
• 经济实惠
• 96孔板设计，通用性强
• 可与HTS兼容

萤火虫(Photinus pyralis)荧光素酶已被证实是检测启动子活性和监测基因转录后调控状态的理想的报告基因。它是在细胞质中作用的酶，分子量61kDa并催化下列反应：
 

以前，应用萤火虫荧光素酶检测遗传因子上调是比较容易的。但是由于检测量纲对基因的下调表达定量过于狭窄，而且例如细胞死亡等非特异因素能降低荧光素酶，它并不是很适合于研究基因表达的下调。因此，通过以单个参比报告基因为标准均一化实验中所用的报告基因就成为区分特异和非特异细胞应答效果影响的有效方法。均一化方法同样是协调转染效率差异和细胞活力差异的有效方法。

用亮度计或荧光读取仪可以发现：发出荧光的光强和荧光素酶的数量成正比例关系。以前，应用萤火虫荧光素酶检测遗传因子上调是比较容易的。但是由于检测量纲对基因的下调表达定量过于狭窄，而且例如细胞死亡等非特异因素能降低荧光素酶，它并不是很适合于研究基因表达的下调。因此，通过以单个参比报告基因为标准均一化实验中所用的报告基因就成为区分特异和非特异细胞应答效果影响的有效方法。均一化方法同样是协调转染效率差异和细胞活力差异的有效方法。

萤火虫和海肾荧光素酶已经被广泛应用于协同报告并进行均一化研究。由于它们都是快速，容易和高灵敏的监测方法。而且萤火虫和海肾荧光素酶是理想的双基因报告系统，因为它们来源于不同的生物进化方向，蛋白结构和底物差异都很大，在实验中不会产生相互影响。

GeneCopoeia充分利用了萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶结构和底物的不同，优化并开发了方便的检测体系可以方便连续地定量测定两种荧光素酶的活性。两种酶酶活活性的检测可以依次在同一样品里检测出。萤火虫荧光素酶的荧光可以被一种试剂激发，并且第二种试剂可同时淬灭萤火虫荧光素酶的荧光和激发海肾荧光素酶酶的荧光。

GeneCopoeia Luc-Pair miR Luciferase Kit开发团队给该产品带来了几点优势和特点，可以增强产品的性能和增加产品的方便性。使用者可以充分感觉到以下几点优势：

1. 该系统已在好几种不同的哺乳动物细胞中测试，经过优化处理可适合高通量监测仪器的micro-plate探头，单孔样品同样可以被监测。
    
2. 该系统只能产生非常微弱的背景荧光（图1）。从读取数值可知：没有差异值是必需的。

   图表 1 GeneCopoeia Luc-Pair miR Luciferase Assay的荧火虫荧光素酶具有低背景的特点

3. 工作溶液I （溶液I中含有底物I）还有所有和裂解细胞有关的组分，并添加了可在同一反应液中与萤火虫荧光素酶反应的底物和稳定剂。
4. 海肾荧光素酶缓冲液含有淬灭萤火虫荧光素酶活性的成分。（图2）
   

   图表 2 加入溶液II后，萤火虫荧光素酶的活性被淬灭。在6孔板中培养HEK293细胞培养一天后，转染pEZX-MT01 质粒（miRNA的荧光素酶报告质粒）转染18小时后，把HEK293细胞移到96孔板中培养24小时，检测激发荧光。根据实验步骤，96孔板的酶活依次被检测。检测完成后，只加溶液II（没有底物II）到右边半板的孔中。整块板在Victor II机器上再次读取荧光，大约95%的萤火虫荧光素酶的荧光被淬灭。

   
   
    
5. 试剂经过多次优化改进后，可以使得萤火虫和海肾荧光素酶的信号相对稳定（图3）。22°C加入适当试剂后30分钟，萤火虫荧光素酶的活性才只有原来的80%，而海肾荧光素酶的活性15分钟后才为原来的80%。
   

   图表 3 GeneCopoeia Luc-Pair miR Luciferase Assay萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的信号的稳定性。在6孔板中培养HEK293细胞培养一天后，转染pEZX-MT01 质粒（miRNA的荧光素酶报告质粒）转染18小时后，把HEK293细胞移到96孔板中培养24小时，检测激发荧光。根据实验步骤，96孔板的酶活依次被检测。某A 公司的双荧光报告系统检测试剂盒用作参比。图3a：萤火虫荧光素酶的酶活信号；图3b海肾荧光素酶的酶活信号。

   
   
   
   
   

    

6. 该系统被设计和优化出在多个数量级别范围内稳定可信的荧光值和质粒浓度间稳定的线性结果。

   (a)	(b)

   图4 检测到的激发荧光（荧光酶酶活的度量）和转化到HEK293 细胞中荧光素酶 质量的线性关系。 HEK293细胞在6孔板中培养一天后，转染不同质量梯度（如图所示）的GeneCopoeia pMRO or pEZX-MT01 质粒（miRNA的荧光素酶报告质粒）转染18小时后，把HEK293细胞移到96孔板中培养24小时，检测激发荧光。如图所示：通过pMRO质粒检测萤火虫荧光素酶的酶活（图：4a）；通过pEZX-MT01质粒检测海肾荧光素酶的酶活（图：4b）。

   
   
7. 可检测3' UTR靶标克隆上靶标受到特定miRNA的抑制效应（图：5）。HEK293细胞在6孔板中培养一天后，转染1.0 mg的 3' UTR表达克隆 (pEZX-MT01-Lin28 UTR-fLuc)和 1.4 mg的miRNA 表达克隆（或 miRNA 参照质粒）。转染18小时后，把HEK293细胞移到96孔板中培养24小时。通过Victor II仪器定量检测萤火虫萤光素酶和海肾萤光素酶酶活。萤火虫萤光素酶和海肾萤光素酶酶活以海肾萤光素酶酶活为基准进行均一化。
    

   图表 6 在293T细胞里foskolin诱导的依赖CRE的荧光素酶表达

8. 在293T细胞里foskolin诱导的依赖CRE的荧光素酶表达（图：6）。 萤火虫荧光素酶基因可以被CRE元件控制（cAMP应答控件），该基因被稳定转染到293细胞系后，细胞在96孔板里培养一天后，体系用不同浓度的foskolin（FSK，乙酰环化酶激活子）再处理16个小时。通过Victor II仪器定量检测萤火虫萤光素酶。（该实验不涉及海肾荧光素酶的酶活）