TUNEL流式细胞仪分析试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

TUNEL流式细胞仪分析试剂是一种旨在使用标准化的生物酶方法，探寻组织或细胞中的DNA断点，即运用修饰过的核苷酸，在末端脱氧核糖核酸转移酶（TdT）的帮助下，对DNA单链或双链上断点处的3’末端进行标记，通过双重参数细胞流式仪定量分析单细胞水平的DNA降解状况的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。主要适用于各种组织或细胞（动物、人体、植物等）的DNA降解测定。广泛用于细胞凋亡的研究。产品严格无菌，即到即用，反应敏感，操作简捷，性能稳定。

技术背景

细胞凋亡，或细胞程序性死亡，在诸如形态发育、免疫系统调节、以及肿瘤和神经退行性疾病等各种生物学过程中，起着实质性的作用。凋亡细胞具有形态、生化、和分子方面的显著特征。其中内源性核酸酶的激活，将DNA链在核小体间连接区切成缺口，使核内DNA断裂成小片断。在组织细胞原位DNA切口处可被末端脱氧核糖核酸转移酶（TdT）标记上生物素dUTP，即TUNEL（Terminal deoxynucleotidyl Transferase Biotin-dUTP Nick End Labeling），然后借助细胞流式仪，探测断点DNA的信息和测定出DNA含量的变化。流式细胞术（FLOW CYTOMETRY）是七十年代发展起来的集计算机、激光、流体力学、细胞化学、细胞免疫学为一体的高科学技术。

产品内容

YIJI固着液（Reagent A）      5 毫升

YIJI通透液（Reagent B）     50毫升

YIJI润湿液（Reagent C）    5毫升

YIJI反应液（Reagent D）    500微升

YIJI酶解液（Reagent E）     10毫升

YIJI终止液（Reagent F）     10毫升

YIJI缓冲液（Reagent G）     10毫升

YIJI染色液A（Reagent H） 1毫升

YIJI清理液（Reagent I）     10毫升

YIJI染色液B（Reagent J） 5毫升

产品说明书 1份

保存方式

保存YIJI通透液（Reagent B）、YIJI反应液（Reagent D）、YIJI酶解液（Reagent E）、YIJI染色液A（Reagent H）和YIJI染色液B（Reagent J）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；YIJI反应液（Reagent D）严禁反复冻融；YIJI染色液A（Reagent H）和YIJI染色液B（Reagent J），避免光照；有效保证6月

用户自备

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（GMS12024）：用于细胞脱离

完全细胞培养液（GMS12052）：用于中和胰蛋白酶的处理

15毫升锥形离心管：用于细胞收集的操作

1.5毫升离心管：用于细胞染色的容器

台式离心机：用于细胞收集的操作

微型台式离心机：用于细胞收集的操作

细胞流式仪：用于细胞荧光分析

实验步骤

实验开始前，将－20℃冰箱里试剂盒中的试剂置入冰槽里融化。然后进行下列操作：

• 准备1个6孔细胞培养板的细胞（5 X 10⁵细胞/孔）
• 小心抽取细胞培养液到15毫升锥形离心管
• 加入1毫升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液
• 放进37℃细胞培养箱孵育1分钟
• 加入3毫升用户自备的完全细胞培养液
• 移取细胞混匀液到上述15毫升锥形离心管
• 放进台式离心机离心10分钟，速度为400g（或1500rpm，例如EPPENDORF 5810R）
• 小心抽去上清液
• 加入500微升4℃预冷的YIJI固着液（Reagent A），上下抽吸混匀
• 放进冰槽里孵育15分钟
• 同时准备1个－20℃预冷的新的15毫升锥形离心管
• 加入5毫升－20℃预冷的YIJI通透液（Reagent B）
• 用1000微升枪头移取细胞混匀液，一滴一滴加入到－20℃预冷的YIJI通透液（Reagent B）里，保持摇动离心管（如暂时停止，可放进－20℃冰箱里保存）
• 放进台式离心机离心10分钟，速度为400g（或1500rpm，例如EPPENDORF 5810R）
• 小心抽去上清液
• 加入500微升YIJI润湿液（Reagent C），用枪头混匀
• 移入到1.5毫升离心管
• 放进微型台式离心机离心5分钟，速度为800g（或3000rpm，例如EPPENDORF 5415D）
• 小心抽去上清液
• 加入50微升YIJI反应液（Reagent D），用枪头混匀
• 放进37℃细胞培养箱孵育60分钟
• 放进微型台式离心机离心5分钟，速度为800g（或3000rpm，例如EPPENDORF 5415D）
• 小心抽去上清液
• 加入1毫升YIJI酶解液（Reagent E），用枪头混匀
• 转移到新的1.5毫升离心管
• 在室温下孵育30分钟
• 放进微型台式离心机离心5分钟，速度为800g（或3000rpm，例如EPPENDORF 5415D）
• 小心抽去上清液
• 加入1毫升YIJI终止液（Reagent F），用枪头混匀
• 在室温下孵育30分钟
• 放进微型台式离心机离心5分钟，速度为800g（或3000rpm，例如EPPENDORF 5415D）
• 小心抽去上清液
• 加入1毫升YIJI缓冲液（Reagent G），用枪头混匀
• 放进微型台式离心机离心5分钟，速度为800g（或3000rpm，例如EPPENDORF 5415D）
• 小心抽去上清液
• 加入100微升YIJI染色液A（Reagent H），用枪头混匀
• 在室温下孵育30分钟
• 加入1毫升YIJI清理液（Reagent I），用枪头混匀
• 放进微型台式离心机离心5分钟，速度为800g（或3000rpm，例如EPPENDORF 5415D）
• 小心抽去上清液
• 重复实验步骤38至40两次（注意：可能肉眼难以看见细胞颗粒群）
• 加入500微升YIJI染色液B（Reagent J），用枪头混匀
• 移入到细胞流式仪专用测试管（可放进4℃冰箱里待测）
• 即刻进行细胞流式仪分析：波长488nm氩离子激光器，观察50000个细胞以上
• 建立地形图或散点图以及直方图分析

注意事项

• 本产品为10次操作量
• 在整个操作过程中须戴手套，以防污染
• 确保实验准确性，须收集所有悬浮和贴壁细胞
• 孵育时，必须避免光照
• 建议细胞染色完成后，即刻进行细胞流式仪分析。如果放进4℃冰箱里待测，不要超过3天
• 细胞流式仪分析前，须混匀内容物
• 细胞检测量不得少于10000个
• 务必测试正常对照组
• 检测时，须弥补电子补偿，以去除双重参数的光谱重叠
• 告知流式仪技术员有关细胞类型
• 本公司提供细胞流式仪分析外包服务
• 本公司提供系列细胞凋亡检测试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定荧光清晰