动物血小板线粒体粗提分离试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

YIJI动物血小板线粒体粗提分离试剂是一种旨在通过低速差速离心和化学渗压休克处理纯化血小板、以及物理或化学破膜和高速差速离心的方法，直接从动物血细胞中分离出完整而纯化的血小板线粒体细胞器的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。适合于人体和各种动物全血（鼠、猪、羊等）中血小板线粒体的制备。其制备物产量高，可以被用于细胞凋亡、衰老、信号传递、能量代谢、蛋白组学和古生物学、病理生理学（神经病变或肿瘤）等的研究。产品不含污染性蛋白酶和核酶，即到即用，性能稳定，分离产量和纯度保证。

技术背景

线粒体细胞器的分离是现代细胞生物学研究的最常用的手段之一。从任何组织或细胞分离线粒体的技术方法基本上采用：第一，通过机械或化学方法破裂细胞；第二，通过低速差速离心去除残渣碎屑和巨大细胞器；第三，通过高速差速离心获得线粒体；甚至，第四，可以通过等密度离心获得纯度更高的线粒体。 

产品内容

YIJI清理液（Reagent A）   250毫升

YIJI裂解液（Reagent B）    40毫升

YIJI净化液（Reagent C）    10毫升

YIJI强化液（Reagent D）     5毫升

YIJI保存液（Reagent E）   100毫升

产品说明书 1份

保存方式

保存YIJI净化液（Reagent C）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，有效保证6月

用户自备

15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器

50毫升锥形离心管：用于样品操作的容器

1.5毫升离心管：用于样品保存的容器

4℃台式离心机：用于样品操作

4℃超速离心机：用于样品操作

DOUNCE匀浆器：用于裂解细胞

超声仪：用于裂解细胞

实验步骤

• 物理处理法

实验开始前，将试剂盒里的YIJI净化液（Reagent C）冻融，然后移出1毫升YIJI净化液（Reagent C）到4毫升的YIJI裂解液（Reagent B）里，混匀后，置入冰槽里，标记为YIJI裂解工作液。然后进行下列操作。

• 准备1个无菌的50毫升锥形离心管
• 轻轻混匀10至20毫升新鲜（2小时内抽取的静脉血）的抗凝全血样品
• 移入到50毫升锥形离心管
• 放进台式离心机离心15分钟，速度为200g
• 小心移取上清液到新的50毫升锥形离心管，留下200微升液体，以防抽取松动的细胞颗粒群
• 用手指轻弹离心管2至3下，使细胞颗粒群松动
• 加入10毫升预冷的YIJI清理液（Reagent A），混匀细胞颗粒群
• 放进台式离心机离心15分钟，速度为200g
• 小心移取上清液合并到上述50毫升锥形离心管，留下200微升液体，以防抽取松动的细胞颗粒群（扔掉含有细胞颗粒群的离心管）
• 放入含有上清液的离心管到台式离心机离心15分钟，速度为200g
• 小心移取上清液到新的50毫升锥形离心管，留下200微升液体，以防抽取松动的细胞颗粒群（扔掉含有细胞颗粒群的离心管）――此步骤获得血小板富集血清
• 放入含有上清液的离心管到台式离心机离心20分钟，速度为2000g
• 可见白色沉淀颗粒群，小心抽掉上清液
• 加入10毫升预冷的YIJI清理液（Reagent A），混匀细胞颗粒群
• 放入台式离心机离心20分钟，速度为2000g
• 小心抽去上清液（注意：如果暂时停止操作，须暂时放进－70℃冰箱里）――此步骤获得纯化的血小板
• 加入5毫升预冷的YIJI裂解工作液
• 涡旋震荡5秒，充分混匀细胞颗粒群
• 即刻放进预冷的DOUNCE匀浆器，在冰槽里用匀浆帮匀化细胞（约10下）（注意：参见注意事项11）
• 将所有细胞匀浆物移入15毫升锥形离心管
• （选择步骤）置于超声仪枪头下，离心管在冰槽里
• （选择步骤）超声功率为60％（或150赫兹）猝击10秒，间隙30秒，10个循环
• 放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1500g
• 小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——此步骤去除未溶解的细胞
• 放进4℃超速离心机离心10分钟，速度为10000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物
• （选择步骤）加入3毫升预冷的YIJI保存液（Reagent E）
• （选择步骤）放进4℃超速离心机再次离心5分钟，速度为10000g
• （选择步骤）小心抽去上清液
• 加入1毫升YIJI保存液（Reagent E），充分混匀
• 即刻移入1.5毫升离心管，放进－70℃冰箱里

• 化学处理法

实验开始前，将试剂盒里的YIJI净化液（Reagent C）冻融，然后移出1毫升YIJI净化液（Reagent C）到4毫升的YIJI裂解液（Reagent B）里，混匀后，置入冰槽里，标记为YIJI裂解工作液。然后进行下列操作。

• 准备1个无菌的50毫升锥形离心管
• 轻轻混匀10至20毫升新鲜（2小时内抽取的静脉血）的抗凝全血样品
• 移入到50毫升锥形离心管
• 放进台式离心机离心15分钟，速度为200g
• 小心移取上清液到新的50毫升锥形离心管，留下200微升液体，以防抽取松动的细胞颗粒群
• 用手指轻弹离心管2至3下，使细胞颗粒群松动
• 加入10毫升预冷的YIJI清理液（Reagent A），混匀细胞颗粒群
• 放进台式离心机离心15分钟，速度为200g
• 小心移取上清液合并到上述50毫升锥形离心管，留下200微升液体，以防抽取松动的细胞颗粒群（扔掉含有细胞颗粒群的离心管）
• （选择步骤）放入含有上清液的离心管到台式离心机离心15分钟，速度为200g
• （选择步骤）小心移取上清液到新的50毫升锥形离心管，留下200微升液体，以防抽取松动的细胞颗粒群（扔掉含有细胞颗粒群的离心管）――此步骤获得血小板富集血清
• 放入含有上清液的离心管到台式离心机离心20分钟，速度为2000g
• 可见白色沉淀颗粒群，小心抽掉上清液
• 加入10毫升预冷的YIJI清理液(Reagent A)，混匀细胞颗粒群
• 放入台式离心机离心20分钟，速度为2000g
• 小心抽去上清液（注意：如果暂时停止操作，须暂时放进－70℃冰箱里）――此步骤获得纯化的血小板
• 入5毫升预冷的YIJI裂解工作液
• 涡旋震荡5秒，充分混匀
• 在冰槽里孵育2分钟，期间涡旋震荡5秒一次
• 加入500微升预冷的YIJI强化液（Reagent D）
• 涡旋震荡5秒，充分混匀
• 在冰槽里孵育5分钟，期间涡旋震荡5秒二次（注意：参见注意事项12）
• 加入5毫升预冷的YIJI保存液（Reagent E），轻轻摇动试管混匀
• 放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1500g
• 小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——此步骤去除未溶解的细胞
• 放进4℃超速离心机离心10分钟，速度为10000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物
• （选择步骤）加入3毫升预冷的YIJI保存液（Reagent E）
• （选择步骤）放进4℃超速离心机再次离心5分钟，速度为10000g
• （选择步骤）小心抽去上清液
• 加入1毫升YIJI保存液（Reagent E），充分混匀
• 即刻移入1.5毫升离心管，放进－70℃冰箱里

注意事项

• 本产品为10次（10至20毫升全血/次）操作
• 其它实际操作的全血容量与试剂使用量按比例调整：例如40毫升全血，试剂用量加倍
• 操作时，避免污染母液，尤其是YIJI裂解液（Reagent B）和YIJI保存液（Reagent E）
• 操作时，须戴手套
• 建议使用新鲜全血：2小时内的全血为理想状态，不要超过24小时
• 全血样品采集须使用全血样品采集须使用EDTA二钾血液抗凝液（GMS12059.1）、ACD血液抗凝液（GMS12059.4），或肝素钠血液抗凝液（GMS12059.5）
• 建议使用足够的样品量
• 血小板提取量因人而异；如果不足，建议增加全血量
• 线粒体操作均须在4℃或以下状态下进行
• 建议严格控制操作时间
• 通常匀化次数为10下（或细胞颗粒群消失为止）达到80％的细胞裂解为理想状态。用户可以通过显微镜观察3微升匀浆物的细胞裂解程度：完整细胞呈现发亮的圆环。低于50％可以增加匀化次数
• 通常孵育5分钟达到80％的细胞裂解为理想状态。用户可以通过显微镜观察3微升裂解物的细胞裂解程度：完整细胞呈现发亮的圆环。低于50％可以增加孵育时间和涡旋震荡次数
• 物理处理法是优先推荐的技术处理
• 通常每毫升全血平均可获得2 X 10⁸血小板
• 通常10毫升全血的血小板线粒体含量为10至25微克线粒体蛋白

16． 如果需要计量线粒体，稀释后数分钟内完成，否则线粒体将分解

17． 本产品所获得的线粒体纯度和产量最为理想。通过调整10000g离心速度到3000至8000g，可以提高粗提的线粒体纯化程度，但线粒体产量相应减少

18． 如果需要获得95％以上纯度的线粒体，使用YIJI动物血小板高质纯化线粒体分离试剂盒－GMS10062.3 

• 线粒体正常活性测定方法是： CITRATE SYNTHASE活性、氧化磷酸化、细胞色素吸收峰谱等
• 线粒体内外膜完整测定方法是：CYTOCHROME C OXIDASE活性和荧光JC染色
• 本公司提供线粒体套餐：ROS、NAO、MitoTRACK、JGB、线粒体溶解等
• 本公司提供系列线粒体试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定分离的线粒体内外膜完整
• 本产品经鉴定分离的线粒体维持正常活性
• 本产品经鉴定不含污染性蛋白酶和核酶