精子细胞氧化应激活性氧（ROS）鲁米诺化学发光法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

精子细胞氧化应激活性氧（ROS）鲁米诺化学发光法定量检测试剂是一种旨在通过自由基探针鲁米诺和强化剂的参与下，精子细胞中的活性氧族使发光物氧化降解并发光，在化学发光仪（Luminometer）的帮助下定量检测精子细胞活性氧族（过氧化氢）的生成和数量的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。适用于动物和人体精子细胞的活性氧族的检测。可以被用于细胞凋亡、衰老、代谢和营养学，以及发育生物学（男性不育）等的研究。产品严格无菌，即到即用，操作简易，性能稳定，检测敏感。

技术背景

超氧自由基阴离子（superoxide radical；O2^-）、过氧化氢（hydrogen peroxide；H2O2）、羟自由基或氢氧基（hydroxyl radical；OH^-）、过氧化基（peroxyl radical；ROO^-）、氢过氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO^-）、过氧亚硝基阴离子（peroxynitrite anion；ONOO^-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、单线态氧气（singlet oxygen）等细胞内活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的产生和增多，将导致细胞衰老或凋亡，甚而导致诸如男性不育、冠心病、风湿性关节炎、肿瘤、退行性病变等各种病理状况。鲁米诺（luminol），又称氨基邻苯二甲酰肼（luminol； 3-aminophthalic hydrazide 5-amino-2,3-dihvdro- 1,4-phthalazinedione），是一种脂溶性的发光剂，氧化后生成鲁米诺自由基而化学发光，具有460nm左右峰值的带状光谱，肉眼可观察到鲜明的紫蓝色。鲁米诺以单价氧化形式与超氧自由基阴离子反应，产生不稳定性内过氧化物或二氧环丁烷（Dioxetane），由此分解成电激发状态，通过释放光子，回复到基态。鲁米诺作为探针，可以检测细胞内外过氧化氢、超氧自由基阴离子和羟自由基，其中过氧化氢最强，其发光强度与过氧化氢水平成正相关。 

产品内容

清理液（Reagent A）     500毫升

强化液（Reagent B）       1毫升

发光液（Reagent C）       1毫升

产品说明书   1份

保存方式

保存强化液（Reagent B）和发光液（Reagent C）在－20℃冰箱里，严格避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保证6月

用户自备

15毫升锥形离心管：用于精子细胞操作的容器

培养箱：用于精子细胞孵育

血细胞计数器：用于精子细胞计数

台式离心机：用于沉淀精子细胞

测试管或黑色96孔板：用于发光检测用的容器

化学发光仪：用于检测化学发光

实验步骤

• 样品预处理

• 移取2毫升新鲜收集（1小时内）的精液到15毫升锥形离心管
• 放进37℃培养箱孵育20分钟
• 放进台式离心机离心7分钟，速度为300g
• 小心抽去上清液
• 加入3毫升清理液（Reagent A），混匀精子细胞颗粒群
• 放进台式离心机离心7分钟，速度为300g
• 小心抽去上清液
• 重复实验步骤5至7一次
• 加入适量的清理液（Reagent A）
• 充分混匀后，在血细胞计数器上进行精子细胞计数
• 调整精子细胞数为20 X 10⁶/毫升
• 放进37℃培养箱里备用（1小时内）

• 测读

测读开始前，打开化学发光仪，设定仪器内温度为37℃预热和整合测读10秒或 15分钟；然后关掉实验室的灯光。将－20℃冰箱里的试剂置入冰槽里融化，严格置于暗室里。然后进行下列操作。

• 准备好测试管，做好标记：阴性对照、样品本底和样品活性
• 移取400微升清理液（Reagent A）到阴性对照测试管
• 移取400微升上述预处理的精子细胞到样品本底测试管
• 移取400微升上述预处理的精子细胞到样品活性测试管
• 分别加入10微升强化液（Reagent B）到上述测试管，除样品本底测试管外
• 分别加入10微升发光液（Reagent C）到上述测试管，除样品本底测试管外
• 轻轻涡旋混匀
• 即刻放进37℃化学发光仪里测读
• 整合测读10秒，获得相对发光单位（relative light unit；RLU）
• 或者整合测读15分钟，获得光电子读数：X 10⁶ CPM（counted photon per minute）（注意：可以使用液体闪烁仪替代）
• 计算ROS水平：

（样品活性－样品本底） ÷ 0.4（毫升；样品容量） ＝相对发光单位（RLU） / 毫升＝相对发光单位（RLU）/20 X 10⁶精子细胞＝X 10⁶ CPM/毫升＝X 10⁶ CPM/20 X 10⁶精子细胞

注意事项

• 本产品为50次操作
• 操作时，须戴手套
• 测试前，精子细胞须新鲜收集，1小时内为最佳
• 精子细胞悬液制备后即刻测读，不宜过夜保存
• 精子细胞悬液须清澈
• 如果需要排除白细胞的干扰，建议纯化精子细胞：精子细胞高纯分离试剂盒（GMS14003）
• 如果需要区分精液各种成分的活性氧生成情况，建议使用精液组分氧化应激活性氧（ROS）鲁米诺化学发光法定量检测试剂盒（GMS10112.3.2）
• 本产品适合冻存的精子细胞检测
• 测读的所有步骤均须在暗室里进行
• 如果测定体系变化，则试剂用量相应变化
• 系统操作过程中，阴性对照只需测定一次
• 如果是注射式化学发光仪，建议测试前后使用无离子水冲洗化学发光仪注射（injector）管道
• 正常精子细胞ROS水平是0.1至1.0 X 10⁶ CPM/2 X 10⁶精子细胞
• 本公司提供系列精子细胞分析试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定检测敏感