植物总抗氧化能力（TAC）比色法（DPPH）定量检测试剂盒产品说明书

（中文版）

主要用途

植物总抗氧化能力（TAC）比色法（DPPH）定量检测试剂是一种旨在通过有机氮自由基染料DPPH的参与，在抗氧化剂的存在下，通过分光光度仪，观察其峰值下降的变化，来定量检测对应于标准水溶性生育酚Trolox的总抗氧化能力，即消除自由基等值浓度的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。适用于各种新新鲜植物组织，包括种子（seed）、叶片（leaf）、根（root）、胚胎叶（cotyledon）、上胚轴（epicotyl）等总抗氧化能力检测。产品严格无菌，即到即用，操作简易，性能稳定。

技术背景

超氧自由基阴离子（superoxide radical；O2^-）、过氧化氢（hydrogen peroxide；H2O2）、羟自由基或氢氧基（hydroxyl radical；OH^-）、过氧化基（peroxyl radical；ROO^-）、氢过氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO^-）、过氧亚硝基阴离子（peroxynitrite anion；ONOO^-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、单线态氧气（singlet oxygen）等细胞内活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的产生和增多，将导致细胞衰老或凋亡，甚而导致诸如冠心病、风湿性关节炎、肿瘤、退行性病变等各种病理状况。在生物系统内，通过抗氧化酶例如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶等，大分子，例如白蛋白、铜蓝蛋白（ceruloplasmin；CER）、铁蛋白（ferritin）和抗氧化因子，例如生育醇、类胡萝卜素、抗坏血酸、还原性谷胱甘肽和尿酸胆红素（bilirubin）等，产生抗氧化能力，即捕获自由基的能力，达到消除或降低ROS的损害。通过稳定的有机氮自由基染料1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazylradical；DPPH），受到抗氧化剂的去自由基作用，呈现深紫色转化为黄色的变化，衡量体系中抗氧化剂捕获自由基、消耗抗氧化剂的能力，在分光光度仪（515nm波长）的帮助下，观察其峰值下降的变化，并与标准化抗氧化剂水溶性生育酚Trolox对照。

产品内容

清理液（Reagent A）     250毫升

低渗液（Reagent B）      25毫升

缓冲液（Reagent C）      20毫升

染色液A（Reagent D1）   1瓶

染色液B（Reagent D2）  10毫升

标准液（Reagent E）     200微升

产品说明书   1份

保存方式

保存清理液（Reagent A）和低渗液（Reagent B）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里，有效保证6月

用户自备

15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器

2毫升离心管：用于样品操作的容器

1.5毫升离心管：用于裂解悬液存放和标准样品配制的容器

4℃微型台式离心机：用于样品操作

超声仪：用于破碎植物细胞

200微升1厘米光径比色皿或96孔板：用于比色的容器

分光光度仪或酶标仪：用于比色分析

实验步骤

• 样品准备

• 准备好新鲜的植物组织（叶片、谷粒、种子等），并秤重以确定200毫克组织重量
• 移入到一个液氮冻存管
• 即刻放进液氮罐过夜
• 次日从液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎组织成粉末状（注意：切莫使组织冻融）
• 放进一个15毫升锥形离心管
• 加入2毫升4℃预冷的 清理液（Reagent A）
• 强力涡旋震荡30秒，充分混匀
• 转移到4℃预冷的2毫升离心管
• 放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为400g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入1毫升4℃预冷的 清理液（Reagent A），混匀
• 放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为400g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去上清液
• 重复实验步骤11至13二次
• 加入500微升低渗液（Reagent B），混匀
• 置于200瓦超声仪枪头下，离心管在冰槽里
• 超声功率为100％，猝击10秒，2个循环
• 放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为10000g（或10000RPM，例如eppendorf 5415）
• 移取上清液到新的4℃预冷的1.5毫升离心管
• 移取10微升进行蛋白定量检测（建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）
• 使用清理液（Reagent A）调整蛋白浓度为100微克/10微升
• 置于冰槽里待测

二、标准液准备

• 准备好5个1.5毫升离心管，标记为1至5号管
• 分别加入50微升缓冲液（Reagent C）到2至5号管
• 移取100微升标准液（Reagent E）到1号管，混匀
• 小心移取50微升1号管的标准液（Reagent E）到2号管，混匀
• 小心移取50微升2号管稀释的标准液（Reagent E）到3号管，混匀
• 小心移取50微升3号管稀释的标准液（Reagent E）到4号管，混匀
• 将1至5号管放进冰槽里备用，避免光照；标准管浓度见下表

• 样品测读

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂置于室温下融化，移取5毫升染色液B（Reagent D2）到1瓶染色液A（Reagent D1）里，混匀，置于暗室里，标记为染色工作液，避免光照。然后进行下列操作。

• 准备1个96孔板，做好标记：空白对照孔、标准样品孔、待测样品孔
• 分别移取205微升缓冲液（Reagent C）到96孔板里的每个孔里
• 分别加入25微升染色工作液 
• 加入20微升缓冲液（Reagent C）到空白对照孔
• 加入20微升上述配制的标准液（Reagent E）到相应标准样品孔里
• 加入20微升样品（100微克蛋白总量）到待测样品孔里
• 轻轻摇动96孔板，使其混匀
• 室温下孵育15分钟
• 即刻放进酶标仪里测读：515nm波长
• 分析结果：
  • 构建标准曲线：纵座标（Y轴）为吸光单位（OD515nm）；横座标（X轴）为标准Trolox浓度（微摩尔/升）
  • 空白对照孔为最大吸光单位（OD515nm）读数
  • 标准样品孔和待测样品孔为实际吸光单位（OD515nm）读数
  • 根据标准曲线获得样品对应Trolox浓度（微摩尔/升）
  • 计算样品实际总抗氧化能力

【根据标准曲线获得样品对应Trolox浓度（微摩尔/升）X 0.25（体系容量；毫升） X 样品稀释倍数】÷0.02（样品容量；毫升）＝（微摩尔/升TROLOX等值）

• 根据下列公式计算测定体系中样品量的总抗氧化能力（实际抑制百分率）

【（空白对照孔吸光单位读数－实际吸光单位读数）÷空白对照孔吸光单位读数】X 100％

• IC50：50％抑制率所需的样品单位：TROLOX等值或样品蛋白浓度（毫克/毫升）或样品容量（微升）

  X（所需样品单位）＝（已知样品单位÷实际抑制百分率）X 50％

注意事项

• 本产品为50次操作，包括标准品
• 本产品测试范围为10至100微摩尔Trolox等值
• 操作时，须戴手套
• 样品制备的所有操作均须在4℃状态下进行
• 用户可以调整标准曲线区间
• 测试前，样品须新鲜收集
• 样品须清澈
• 空白对照孔的吸光读数应为1.0左右为佳
• 样品读数越低，抗氧化能力越高
• 可以使用比色皿检测
• 如果样品抗氧化剂浓度过高或过低， 建议稀释或增加样品容量或浓度
• 如果测试样品很多，建议使用排枪移液
• 本公司提供系列抗氧化分析试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定检测敏感