细胞总抗氧化能力（TAC）荧光法（ORAC）定量检测试剂盒产品说明书

（中文版）

主要用途

细胞总抗氧化能力（TAC）荧光法（ORAC）定量检测试剂是一种旨在通过使用荧光素探针，受到有机氮自由基AAPH的破坏，但在抗氧化剂的存在下，得到抑制，由此通过荧光分光光度仪，观察其峰值下降程度的变化，来定量检测对应于标准水溶性生育酚Trolox的总抗氧化能力，即消除自由基等值浓度的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。适用于适用于各种新鲜细胞样品总抗氧化能力检测。产品严格无菌，即到即用，操作简易，性能稳定。

技术背景

超氧自由基阴离子（superoxide radical；O2^-）、过氧化氢（hydrogen peroxide；H2O2）、羟自由基或氢氧基（hydroxyl radical；OH^-）、过氧化基（peroxyl radical；ROO^-）、氢过氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO^-）、过氧亚硝基阴离子（peroxynitrite anion；ONOO^-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、单线态氧气（singlet oxygen）等细胞内活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的产生和增多，将导致细胞衰老或凋亡，甚而导致诸如冠心病、风湿性关节炎、肿瘤、退行性病变等各种病理状况。在生物系统内，通过抗氧化酶例如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶等，大分子，例如白蛋白、铜蓝蛋白（ceruloplasmin；CER）、铁蛋白（ferritin）和抗氧化因子，例如生育醇、类胡萝卜素、抗坏血酸、还原性谷胱甘肽和尿酸胆红素（bilirubin）等，产生抗氧化能力，即捕获自由基的能力，达到消除或降低ROS的损害。通过氧自由基吸光能力（oxygen radical absorbance capacity；ORAC），即使用荧光素（fluorescein）作为探针，2,2'-偶氮二异丁基脒二盐酸盐（2,2-azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride；AAPH）作为过氧自由基供体（peroxyl radical donor），其攻击探针，产生荧光淬灭，一旦受到抗氧化剂作用，而防止荧光消失，由此评价抗氧化潜力和活性，也就是自由基去除作用（free radical scavenging），在荧光分光光度仪（激发波长485nm±20，散发波长528nm±20）的帮助下，观察其峰值下降程度的变化，并与标准化抗氧化剂水溶性生育酚Trolox对照。

产品内容

清理液（Reagent A）     300毫升

低渗液（Reagent B）      25毫升

缓冲液（Reagent C）       4毫升

染色液（Reagent D）     7.5毫升

氧化液（Reagent E）       1管

标准液（Reagent F）     200微升

产品说明书   1份

保存方式

保存清理液（Reagent A）、低渗液（Reagent B）和缓冲液（Reagent C）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里，避免光照；有效保证6月

用户自备

15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器

1.5毫升离心管：用于标准样品配制的容器

4℃（微型）台式离心机：用于样品操作

细胞刮脱棒：用于脱离细胞

超声仪：用于破碎细胞

200微升1厘米光径比色皿或黑色96孔板：用于荧光分析的容器

荧光分光光度仪或荧光酶标仪：用于荧光分析

实验步骤

• 样品准备

• 准备好25cm²细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 X 10⁶细胞）
• 小心加入3毫升清理液（Reagent A），覆盖生长表面
• 小心抽去清理液
• 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：可以使用胰酶消化）
• 加入2毫升清理液（Reagent A），混匀细胞
• 移入到预冷的2毫升离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）
• 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g
• 小心抽去上清液
• 加入500微升低渗液（Reagent B），混匀
• 置于200瓦超声仪枪头下，离心管在冰槽里
• 超声功率为100％，猝击10秒，2个循环
• 放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为10000g（或10000RPM，例如eppendorf 5415）
• 移取上清液到新的4℃预冷的1.5毫升离心管
• 移取10微升进行蛋白定量检测（建议使用 BCA蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30031.1）
• 使用清理液（Reagent A）调整蛋白浓度为100微克/25微升
• 置于冰槽里待测

二、标准液准备

• 准备好5个1.5毫升离心管，标记为1至5号管
• 分别加入50微升缓冲液（Reagent C）到2至5号管
• 移取100微升标准液（Reagent F）到1号管，混匀
• 小心移取50微升1号管的标准液（Reagent F）到2号管，混匀
• 小心移取50微升2号管稀释的标准液（Reagent F）到3号管，混匀
• 小心移取50微升3号管稀释的标准液（Reagent F）到4号管，混匀
• 将1至5号管放进冰槽里备用，避免光照；标准管浓度见下表

• 样品测读

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂置于室温下融化，移取1.5毫升缓冲液（Reagent C）到1管氧化液（Reagent E）里，混匀，置于暗室里，标记为氧化工作液，避免光照。然后进行下列操作。

• 准备1个黑色96孔板，做好标记：最大对照孔、标准样品孔、待测样品孔
• 分别移取150微升染色液（Reagent D）到黑色96孔板里的每个孔里
• 加入25微升缓冲液（Reagent C）到最大对照孔
• 加入25微升上述配制的标准液（Reagent F）到相应标准样品孔里
• 加入25微升样品（100微克蛋白总量）到待测样品孔里
• 放进37℃培养箱里孵育30分钟
• 分别加入25微升氧化工作液到标准样品孔和待测样品孔里 
• 加入25微升缓冲液（Reagent C）到最大对照孔
• 轻轻摇动黑色96孔板，使其混匀
• 放进37℃培养箱里孵育15分钟
• 即刻放进荧光分光光度仪或荧光酶标仪里测读：激发波长485nm±20，散发波长528nm±20
• 分析结果：
  • 构建标准曲线：纵座标（Y轴）为荧光单位；横座标（X轴）为标准Trolox浓度（微摩尔/升）
  • 最大对照孔为最大荧光单位读数
  • 标准样品孔和待测样品孔为实际荧光单位读数
  • 根据标准曲线获得样品对应Trolox浓度（微摩尔/升）
  • 计算样品实际总抗氧化能力

【根据标准曲线获得样品对应Trolox浓度（微摩尔/升）X 0.2（体系容量；毫升） X 样品稀释倍数】÷0.025（样品容量；毫升）＝（微摩尔/升TROLOX等值）

• 根据下列公式计算测定体系中样品量的总抗氧化能力（实际抑制百分率）

【实际荧光单位读数÷最大对照孔荧光单位读数】X 100％

• IC50：50％抑制率所需的样品单位：TROLOX等值或样品蛋白量（毫克/毫升）或样品细胞量（10⁶细胞）

  X（所需样品单位）＝（已知样品单位÷实际抑制百分率）X 50％

注意事项

• 本产品为50次操作，包括标准品
• 本产品测试范围为100纳摩尔至1微摩尔Trolox等值
• 操作时，须戴手套
• 样品制备的所有操作均须在4℃状态下进行
• 用户可以调整标准曲线区间
• 测试前，样品须新鲜收集
• 样品须清澈
• 样品读数越高，下降程度越小，抗氧化能力越高
• 可以使用比色皿检测
• 如果样品抗氧化剂浓度过高或过低， 建议稀释或增加样品容量或浓度
• 如果测试样品很多，建议使用排枪移液
• 本公司提供系列抗氧化分析试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定检测敏感