精子细胞氧化应激活性氧（ROS）NBT比色法定量检测试剂盒产品说明书

（中文版）

主要用途

精子细胞氧化应激活性氧（ROS）NBT比色法定量检测试剂是一种旨在通过硝基蓝四氮唑染料，受到超氧阴离子O₂^-的还原，产生不溶性蓝黑色色素沉淀，由分光光度仪比色分析，定量检测精子细胞内活性氧族的生成和增加的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。适用于动物和人体精子细胞的活性氧族的检测。可以被用于细胞凋亡、衰老、代谢和营养学，以及发育生物学（男性不育）等的研究。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，显色清晰。

技术背景

超氧自由基阴离子（superoxide radical；O2^-）、过氧化氢（hydrogen peroxide；H2O2）、羟自由基或氢氧基（hydroxyl radical；OH^-）、过氧化基（peroxyl radical；ROO^-）、氢过氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO^-）、过氧亚硝基阴离子（peroxynitrite anion；ONOO^-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、单线态氧气（singlet oxygen）等细胞内活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的产生和增多，甚而导致诸如男性不育、冠心病、风湿性关节炎、肿瘤、退行性病变等各种病理状况。其中精子细胞（spermatozoa）对于活性氧较为敏感：低浓度活性氧可以调节正常精子功能、精子获能、顶体反应、精卵融合等；高浓度活性氧则影响精子细胞的质量和功能，因为精子细胞质膜含有大量不饱和脂肪酸，胞浆含有少量的祛除活性氧的相关酶蛋白，由此活性氧容易造成精子质膜的流动性和DNA完整性受到损害，精子运动能力降低，不能参与授精活动，最终导致特发性不育症（idiopathic infertility）。染料四氮唑兰（tetrazolium）化合物，硝基蓝四氮唑（Nitro Blue Tetrazolium；NBT），是一种黄色水溶性硝基替代性芳香族四氮唑化合物，与细胞内超氧阴离子O₂^-反应而被直接还原，产生不溶性甲暨色素，在分光光度仪下（650nm波长），呈现吸光峰值的变化。据此定量检测精子细胞内氧化应激活性氧族的浓度。

产品内容

清理液（Reagent A）    500毫升

染色液（Reagent B）      1瓶

溶解液（Reagent C）     10毫升

产品说明书 1份

保存方式

保存染色液（Reagent B）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保证6月

用户自备

2毫升离心管：用于样品操作的容器

1.5毫升离心管：用于样品操作的容器

（微型）台式离心机：用于样品操作

细胞培养箱：用于精子细胞染色孵育

96孔板：用于比色分析的容器

酶标仪：用于比色分析

实验步骤

• 样品预处理

• 移取2毫升新鲜收集（1小时内）的精液到2毫升离心管
• 放进37℃培养箱孵育20分钟
• 放进微型台式离心机离心7分钟，速度为300g
• 小心抽去上清液
• 加入2毫升清理液（Reagent A），混匀精子细胞颗粒群
• 放进台式离心机离心7分钟，速度为300g
• 小心抽去上清液
• 加入适量的清理液（Reagent A）
• 充分混匀后，在血细胞计数器上进行精子细胞计数
• 调整精子细胞数为1 X 10⁷/毫升
• 放进37℃培养箱里备用（1小时内）

• 样品检测

实验开始前，移出10毫升清理液（Reagent A）到1瓶染色液（Reagent B）瓶里，混匀后，标记为染色工作液，置于冰槽里备用（注意，用完后即刻放回－20℃冰箱里）。然后进行下列操作。

• 移取100微升上述预处理的精子细胞到1.5毫升离心管
• 加入100微升染色工作液，混匀
• 放进37℃细胞培养箱里孵育45分钟
• 放进微型台式离心机离心10分钟，速度为500g
• 小心抽去上清液
• 加入500微升清理液（Reagent A）
• 放进微型台式离心机离心10分钟，速度为500g
• 小心抽去清理液
• 重复实验步骤6至8一次
• 加入100微升溶解液（Reagent C），混匀

11． 在室温下，孵育5分钟

12． 即刻转移到96孔板

13． 放进酶标仪测读，波长为650 nm

• 构建精子细胞内活性氧生成曲线：纵座标（Y轴）为活性氧吸光值（OD）；横坐标（X轴）为细胞数、时间点或药物处理浓度等
• 或计算ROS水平：

（样品读数－本底读数） ÷ 0.1（毫升；样品容量） ＝吸光单位（OD） / 毫升＝吸光单位（OD）/1 X 10⁷精子细胞 

注意事项

• 本产品为100次（96孔板）操作
• 操作时，须戴手套
• 孵育时，须避免光照
• 测试前，精子细胞须新鲜收集，1小时内为最佳
• 精子细胞悬液制备后即刻测读，不宜过夜保存
• 精子细胞悬液须清澈
• 如果需要排除精液白细胞的干扰，建议纯化精子细胞：精子细胞高纯分离试剂盒（14003）
• 如果需要区分精液各种成分的活性氧生成情况，建议使用精浆（seminal plasma）氧化应激活性氧（ROS）NBT比色法定量检测试剂盒（14007.2）
• 本产品适合冻存的精子细胞检测
• 如果活性氧浓度过低，可以延长孵育时间至2小时
• 本公司提供系列精子细胞分析试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定检测敏感