细菌趋化作用（chemotaxis）软琼脂检测试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

细菌趋化作用（chemotaxis）软琼脂检测试剂是一种旨在采用半固体琼脂糖，构建化学趋化物（chemoattractant）弥散形成浓度差异的空间，观察细菌群移现象、环形（ring）标志，以及空白区域等外观形态，进行分析细菌趋化作用的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其特别适用于各种细菌以及突变型、转基因处理细菌的趋化性研究和筛选，同时检测趋化因子和抑制因子的作用。产品严格无菌，即到即用，性能稳定，操作简便，重复一致。

技术背景

趋化性（chemotaxis）是指细胞或生物体对于介质中的特定化学分子的浓度差异形成的刺激所引起的趋向运动。许多种类的游动细胞具有趋化性，例如细菌和阿米巴细胞朝着食物源移动；人体免疫细胞包括巨噬细胞和中性白细胞朝着外来入侵细胞移动。此外，许多在发育进程中发生的形态变化与细胞向化学物质浓度差异趋化移动相关。细菌趋化性是细胞感受化学信号，由膜结合受体连接到细胞内传递机制，通过鞭毛运动产生相应的移动反应。细菌趋化性检测包括时相（temporal）和空间（spatial）梯度检测。其中软琼脂群移平板检测（soft-agar swarming plate assay）是空间梯度分析的常用方法。作为半固体介质之一的琼脂糖（Agarose），构建化学趋化物（chemoattractant）弥散形成浓度差异的空间，观察细菌群移现象、环形（ring）标志，以及空白区域等外观形态，进一步分析野生型和突变型细菌，以及化学引诱分子（chemoattractant）和化学排斥分子（chemorepellent）的趋向变化。

产品内容

通用介质液（Reagent A） 100毫升

选择介质液（Reagent B） 100毫升

重悬液（Reagent C）  10毫升

产品说明书   1份

保存方式

保存在4℃的冰箱里；有效保证6月 

用户自备

50毫升锥形离心管：用于混匀介质液的容器

100mm培养皿：用于细菌趋化实验的容器

恒温水浴：用于试剂保温

微型台式离心机：用于样品操作

培养箱：用于细菌培养

量尺：用于测量细菌移动距离

实验步骤

一、 琼脂平板准备

1． 将通用介质液（Reagent A）或选择介质液（Reagent B）置于微波炉里加热溶化（注意：避免溢出）

2． 放进50℃恒温水浴

3． 移出20毫升通用介质液（Reagent A）或选择介质液（Reagent B）到50毫升锥形离心管

4． 即刻加入1毫升用户自备的待测的化学趋化分子

5． 上下倾倒混匀

6． 最快速度倒入100mm培养皿

7． 均匀铺满整个底面，避免气泡产生

8． 置于室温下至少2小时或4℃冰箱里1小时，使胶体凝固

9． 倒置培养皿，在其外底面，用尺和标记笔做好标记――根据检测要求设置如下：

1）一板多点

2）一板单点

二、 细菌准备

1． 准备10毫升过夜生长的新鲜的培养细菌（OD590=0.4，达5 X 10⁷细菌/毫升）

2． 移取1毫升到新的1.5毫升离心管

3． 放进微型台式离心机离心10分钟，速度为1000g

4． 小心抽掉上清液

5． 加入1毫升重悬液（Reagent C），混匀

6． 置于冰槽里备用

三、 趋化实验

1． 加入10微升上述准备的待测细菌到相应的标记点位

2． 室温下静置30分钟

3． 小心放进35℃培养箱孵育6至8小时（一板多点）或24至48小时（一板单点），保持培养箱湿润

4． 观察细菌群移现象：建议每隔2小时观察1次

5． 直至出现趋化环

6． 结果分析：

1) 使用量尺进行细菌移动距离测量：细菌点和细菌趋化环之间的距离

2) 细菌趋化环密度计量：包括所有移动细胞，或设定移动区域的细胞

7． 构建距离、密度、时间、趋化物浓度包括空白对照的关系曲线

8． 确定趋化系数（chemokinesis coefficiency）：趋化物浓度和细菌移动密度的关系曲线的斜率

注意事项

• 本产品为10次（100mm培养皿）操作
• 其它实际操作的培养皿大小与试剂使用量按比例调整
• 所有培养操作和使用工具均须在严格无菌状态下进行
• 操作时须戴手套
• 建议使用系列趋化物浓度进行检测比较；注意一板只能进行一种浓度检测
• 通常不同细菌分析比较，可以采用一板多点
• 通用介质液（Reagent A）常用于不同细菌（例如突变菌等）的比较分析或明确趋化分子的检测；更适合于排斥分子的分析
• 选择介质液（Reagent B）常用于单一趋化分子或未知趋化分子的分析
• 建议待测细菌量为10⁵细菌/样品点 
• 建议细菌为新鲜培养
• 已经铺板但暂时保存的含凝胶体的培养板或培养皿，用PARAFILM密封，在4℃冰箱里储存
• 操作时小心轻柔，避免胶体脱位
• 通常细菌移动为4至24小时之间；注意随时观察，避免细菌移动过快，失去分析良机
• 排斥分子检测可以持续观察至48小时终止
• 通用介质液（Reagent A）的正常细菌的趋化性参考图像

• 选择介质液（Reagent B）的正常细菌的单一趋化分子的趋化性参考图

• 本公司提供系列细胞趋化分析试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定无病毒和支原体污染
• 本产品经鉴定重复率好