动物糖蛋白酶解法完全糖基分解试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

动物糖蛋白酶解法完全糖基分解试剂是一种旨在通过N-和O-双重糖苷酶的特异作用序列，达到糖蛋白中的天门冬酰胺和丝氨酸/苏氨酸链接的糖基和蛋白分子分离，而获得纯化寡聚糖或蛋白分子的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种糖蛋白的完全分离纯化。产品即到即用，性能稳定，操作便捷，分离效率高。

技术背景

很多真核生物蛋白的主要结构成分包含天门冬酰胺（asparagine），即N-糖基；或丝氨酸/苏氨酸（serine/threonine）链接，即O-糖基的寡聚糖（oligopolisaccharide）。其作用于蛋白分类、免疫识别、受体结合、炎症反应、病理性和其它生物过程。寡聚糖的结构多样性以及磷酸化、硫化等导致糖蛋白的质量和电荷的异质性。其中N-糖基寡聚糖将增加3.5kd糖蛋白质量；而O-链接的寡聚糖的质量较之N-链接要小，但也呈现多样化和异质性。此外，唾液酸的存在与否直接影响糖蛋白的质量和电荷。通过选择性去糖基化（deglycosylation）处理，便于糖蛋白的氨基酸序列和晶体结构分析、确定糖基的作用包括可溶性、抗原性、受体结合性等。去糖基化处理通常使用肼解法（hydrazinolysis）、化学法和生物酶法。肼解法可以完全去除N-和O-糖基，但同时毁损了蛋白质成分而无法复性；化学法产生不完全性糖基去除，以及部分蛋白分子毁损；生物酶具有完全去糖基化，且蛋白质不会降解。同时使用N-糖苷酶（N-glycanase）和O-糖苷酶（O-glycanase），特异性地去除所有N-和O-链接的寡聚糖，除了天门冬酰胺链接的N-乙酰葡糖胺（N-acetylglucosamine）和丝氨酸/苏氨酸（serine/threonine）链接的半乳糖等。

产品内容

缓冲液（Reagent A） 200微升

变性液（Reagent B）  50微升

活性液（Reagent C）  50微升

酶解液（Reagent D）       20微升

产品说明书       1份

保存方式

保存酶解液（Reagent D）在－20℃冰箱里，避免反复冻融；其余的保存在4℃冰箱里；有效保证6月

用户自备

1.5毫升离心管：用于反应操作和保存样本的容器

电炉：用于煮沸反应内容物

恒温培养箱或恒温水槽：用于反应孵育

实验步骤

实验开始前，将酶解液（Reagent D）从－20℃冰箱里取出，在冰槽里融化。然后进行下列操作。

• 变性法

• 准备1个1.5毫升离心管
• 移入30微升目标蛋白样品（100微克）
• 加入10微升缓冲液（Reagent A）
• 加入2.5微升变性液（Reagent B）
• 使用200微升枪头抽吸混匀
• 煮沸5分钟（注意：避免液体挥发）
• （选择步骤）如果煮沸出现沉淀，建议使用在37℃培养箱里孵育24小时替代
• 室温下静置15分钟
• 加入2.5微升活性液（Reagent C），混匀
• 加入1微升酶解液（Reagent D）
• 放进37℃培养箱里孵育3小时
• 即刻放进－70℃冰箱里保存
• 或进行各种后续检测

• 非变性法

• 准备1个1.5毫升离心管
• 移入35微升目标蛋白样品（100微克）
• 加入10微升缓冲液（Reagent A）
• 使用200微升枪头抽吸混匀
• 加入1微升酶解液（Reagent D）
• 放进37℃培养箱里孵育72小时
• 即刻放进－70℃冰箱里保存
• 或进行各种后续检测

注意事项

• 本产品为20次操作
• 本产品不适用于唾液酸链接型寡聚糖糖蛋白
• 操作时，须戴手套
• 变性法确保完全有效切离，但蛋白天然结构发生改变；如果需要维持蛋白的酶活或抗原性，则使用非变性操作
• 酶解液（Reagent D）避免反复冻融，建议分装 
• 酶解液（Reagent D）的切离能力取决于糖蛋白的三维结构、链接元素等各种因素  
• 增加切离能力的方法是：延长孵育时间（至120小时）
• 如果纯化效果欠佳，建议增加使用内切糖苷酶（endoglycosidase A）或β1,4-半乳糖苷酶（β1,4-galactosidase）等酶切
• 本公司提供系列糖蛋白处理试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定分离效果满意