组织a-淀粉酶（a-AMYLASE）活性DNS比色法定量检测试剂盒产品说明书

（中文版）

主要用途

组织a-淀粉酶（a-AMYLASE）活性DNS比色法定量检测试剂是一种旨在使用具有还原力的黄色3,5-二硝基水杨酸与受到a-淀粉酶中性环境下水解产生的还原基团分子反应，生成强烈吸光的3-氨基-5-硝基水杨酸，即采用比色法测定其还原后峰值的升高变化，以此测定样品中a-淀粉酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适合于各种组织（人体、动物）等裂解萃取液样品a-淀粉酶的活性检测。产品不含污染性蛋白酶，严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，反应优化，检测敏感。

技术背景

淀粉酶（AMYLASE）属于糖苷水解酶类（glycoside hydrolase）。淀粉酶通过水解方式，分解淀粉的α-1，4链接，释放出葡萄糖、麦芽糖（maltose）、麦芽三糖（maltotriose）、糊精（dextrin）等简单糖分子。淀粉酶分成三类：α-淀粉酶、β-淀粉酶和γ-淀粉酶。其中α淀粉酶（EC 3.2.1.1），又称为α-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶（α-1,4-glucan 4-glucanohydrolase）或糖原酶（glycogenase），是钙离子依赖性钙金属蛋白酶（calcium metalloenzyme），分解淀粉为葡萄糖、麦芽糖（maltose）、麦芽三糖（maltotriose）、糊精（dextrin）等，为主要的消化酶，尤其在人体中，例如唾液和胰淀粉酶等。β淀粉酶（EC 3.2.1.2），又称为α-1,4-葡聚糖麦芽糖水解酶（1,4-α-D-glucan maltohydrolase）或糖基淀粉酶（saccharogen amylase），分解淀粉为葡萄糖等。植物、真菌、细菌等均能产生，而人体组织不含有。γ-淀粉酶（EC 3.2.1.2），又称为α-1,4-葡聚糖葡萄糖苷酶（Glucan 1,4-α-glucosidase）或溶酶体α-葡萄糖苷酶（lysosomal α-glucosidase），在酸性环境下分解淀粉为葡萄糖。淀粉是一种复杂分子，由多聚糖直链淀粉（amylose）和支链淀粉（amylopectin）构成。基于淀粉，在中性环境下，通过α-淀粉酶的水解，释放出麦芽糖等含有游离的还原性基团（例如酮基等），进一步使用具有还原力的黄色3,5-二硝基水杨酸（3,5-Dinitrosalicylic acid；DNS）与之反应，产生红棕色的3-氨基-5-硝基水杨酸（3-amino-5-nitrosalicylic acid），在分光光度仪（540nm波长）下测定，以定量分析α-淀粉酶的活性。其反应方式为：   

α-AMYLASE

Starch  +  H2O       →      reducing groups（maltose）

Maltose  +  3,5-Dinitrosalicylic acid  →  3-amino-5-nitrosalicylic acid  +  maltonic acid

产品内容

清理液（Reagent A）  60毫升

裂解液（Reagent B）  10毫升

缓冲液（Reagent C）  20毫升

反应液（Reagent D）   5毫升

底物液A（Reagent E）   5毫升

底物液B（Reagent F）  20毫升

补充液（Reagent G）  50毫升

标准液（Reagent H）     2毫升

产品说明书      1份

保存方式

保存 在4℃冰箱里；底物液B（Reagent F），避免光照，有效保证6月

用户自备

15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器

1.5毫升离心管：用于样品操作的容器

2.2毫升离心管：用于配制标准样品的容器

4℃（微型）台式离心机：用于样品处理

沸水装置：用于反应物孵育

比色皿：用于比色测定的容器

分光光度仪：用于比色分析

实验步骤

一、样品准备

• 手术取出动物组织，并秤重以确定500毫克组织重量 
• （选择步骤）放进预冷的15毫升锥形离心管
• （选择步骤）加入3毫升清理液（Reagent A）清洗1次
• 移入到一个液氮冻存管
• 即刻放进液氮罐过夜
• 次日从液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎组织成粉末状（注意：切莫使组织冻融）
• 放进一个15毫升锥形离心管
• 加入预冷的500微升裂解液（Reagent B） 
• 转移到预冷的1.5毫升离心管
• 强力涡旋震荡30秒，充分混匀
• 置于冰槽里孵育30分钟，期间每10分钟强力涡旋震荡30秒（注意：如需暂时停止，放进－70℃冰箱里储存备用）
• 放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
• 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）
• 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作（注意：后续操作须在2小时内完成）

二、测定准备

• 从-70℃取出待测样品（例如细胞裂解悬液样品等），置于冰槽里
• 设定好分光光度仪（温度为25℃）：波长为540nm，并置零 
• 缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度
• 测定开始前，移出800微升底物液B（Reagent F）到新的1.5毫升离心管，加入200微升底物液A（Reagent E），混匀后，置于冰槽里，标记为底物工作液（2次操作），放在暗室里备用。然后进行下列操作

• 标准样品测定

• 准备好5个2.2毫升离心管，标记为1至5号管
• 分别加入1毫升缓冲液（Reagent C）到1至5号管
• 移取1毫升标准液（Reagent H）到1号管，混匀
• 小心移取1毫升1号管稀释的标准液（Reagent H）到2号管，混匀
• 小心移取1毫升2号管稀释的标准液（Reagent H）到3号管，混匀
• 小心移取1毫升3号管稀释的标准液（Reagent H）到4号管，混匀
• 将1至5号管放进冰槽里备用；标准管浓度见下表

• 分别移取500微升上述配制的系列标准液（Reagent H）到1.5毫升离心管
• 分别加入500微升上述配制的底物工作液
• 在沸水里孵育5分钟 ，避免光照
• 在室温下静置15分钟冷却，避免光照
• 分别移取100微升上述反应液到新的比色皿
• 分别加入1毫升补充液（Reagent G），混匀
• 即刻放进分光光度仪检测：获得吸光读数
• 重复实验步骤8至14四次
• 构建标准曲线：纵座标（Y轴）为吸光单位；横座标（X轴）为标准麦芽糖浓度（毫摩尔/升）

• 样品和背景测定

• 移取200微升缓冲液（Reagent C）到新的1.5毫升离心管
• 加入50微升待测样品（100微克裂解萃取蛋白）或补充液（Reagent G）
• 25℃温度下，孵育3分钟
• 分别加入250微升反应液（Reagent D），混匀
• 25℃温度下，孵育3分钟
• 分别加入500微升上述配制的底物工作液
• 在沸水里孵育5分钟，避免光照
• 在室温下静置15分钟冷却，避免光照
• 分别移取100微升上述反应液到新的比色皿
• 分别加入1毫升补充液（Reagent G），混匀
• 即刻放进分光光度仪检测：获得吸光读数
• 实际样品吸光读数：样品吸光读数－背景吸光读数
• 根据标准曲线获得样品对应麦芽糖浓度（毫摩尔/升）
• 测算样品酶活性：

【根据标准曲线获得样品对应麦芽糖浓度（毫摩尔/升）X样品稀释倍数】÷3 （反应时间；分钟）＝微摩尔MALTOSE/毫升/分钟÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝微摩尔MALTOSE/毫克/分钟

注意事项

• 本产品为25次操作，包括标准样品测定
• 操作时，须戴手套
• 底物工作液注意避光
• 样品检测前，须溶解和澄清
• 比色测定后，比色皿须清洗彻底
• 测定值由低到高变化，表明有酶活性
• 建议待测样本蛋白浓度为100微克/50微升；如果样本酶活性过低，则可以增加样本量（本公司提供 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒30030.1）
• 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
• a-淀粉酶活性单位浓度定义：在25℃室温下，pH 6.9的情况下，每单位酶在单位时间内（每分钟）释放1微摩尔的麦芽糖分子
• 本公司提供系列淀粉酶学分析技术产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定检测准确