血液总脂肪酶（lipase）活性比色法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

血液总脂肪酶（lipase）活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过底物三丁酸二巯基丙醇受到脂肪酶水解，释放出巯基基团，使用Ellman试剂，产生黄色5-巯基-2-硝基苯甲酸产物吸光峰值的变化，即采用比色法来测定样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心改良、成功实验证明的。其适用于各种动物和人体血液（血浆、血清等）样品脂肪酶的总活性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。

技术背景

脂肪酶（lipase；EC3.1.1.3）是可溶性糖蛋白分子，催化不溶性脂质分子的酯键（ester bond）的水解。在人体中，其来源于胰腺产生。在消化系统中，脂肪酶（Lipase），裂解脂肪分子，例如甘油三酯（triglyceride；TAG），产生1个分子甘油（glycerol）和3个分子游离脂肪酸分子（fatty acid）。脂肪酶异常增高与胰腺炎、胰腺管阻塞、胰腺癌、肾病、唾液腺炎症、肠道阻塞等相关；异常降低则与胰腺中脂肪酶产生细胞的永久性损伤有关。脂肪酶的活性检测是临床诊断的指标之一。基于脂肪酶在水分子的参与下，催化三丁酸二巯基丙醇（dimercaptopropanol tributyrate；DMPTB或BALB）的水解，产生二巯基丙醇（dimercaptopropanol；DMP），并释放出巯基基团（－SH），进而与Ellman试剂5,5-二硫基-双（2-硝基苯甲酸）[5,5’-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid）；DTNB]反应后，产生黄色的5-巯基-2-硝基苯甲酸（5-thio-2-nitrobenzoic acid；TNB），通过其吸收峰值的变化（412nm波长），来定量分析脂肪酶的活性。脂肪酶反应系统为：

lipase

DMPTB  +  H2O  →  DMP  +  TB

DTNB  +  DMP -SH  →   TNB  +  DMP -S-S-TNB

产品内容

缓冲液（Reagent A） 10毫升

反应液（Reagent B）  1毫升

底色液（Reagent C）     500微升

补充液（Reagent D）     500微升

产品说明书      1份

保存方式

保存反应液（Reagent B）和底色液（Reagent C）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；底色液（Reagent C）避免光照，有效保证6月

用户自备

1.5毫升离心管：用于样品操作的容器

微型台式离心机：用于样品制备

恒温水槽：用于孵育反应

比色皿或96孔板：用于反应和比色的容器

分光光度仪或酶标仪：用于比色分析

实验步骤

• 样品准备

选择一：血浆样品

• 准备好肝素或ACD等抗凝管（注意：避免使用EDTA抗凝管）
• 抽取1毫升血液，置于抗凝管里
• 放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为700g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上层黄色液体到新的1.5毫升离心管――此为血浆成分（注意：避免触碰白色液体层）
• 即刻置于冰槽里备用或放进－70℃冰箱里保存
• （选择步骤）移取10微升进行蛋白定量测定 （注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）

选择二：血清样品

1． 准备好不含抗凝剂的储存管 

• 抽取1毫升血液，置于储存管里
• 室温下，静置30分钟，直至血液凝结
• 放进4℃微型台式离心机离心15分钟，速度为2000g（或5000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上层黄色液体到新的1.5毫升离心管――此为血清成分（注意：避免触碰白色液体层）
• 即刻置于冰槽里备用或放进－70℃冰箱里保存
• （选择步骤）移取10微升进行蛋白定量测定 （注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）

• 测定准备

• 准备好待测样品，置于冰槽里
• 设定好分光光度仪（温度为37℃）：波长412nm，间隔10分钟，读数4次（共30分钟），并置零 
• 缓冲液（Reagent A）室温下均衡温度

三、背景对照测定

• 移取910微升缓冲液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入40微升底色液（Reagent C）
• 上下倾倒数次，混匀
• 在37℃温度下孵育3分钟
• 加入50微升待测样品（或100微克蛋白）（注意：样品须清澈）
• 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
• 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照（30分钟读数－0分钟读数）

• 样品测定

• 移取810微升缓冲液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入100微升反应液（Reagent B）
• 加入40微升底色液（Reagent C）
• 上下倾倒数次，混匀
• 在37℃温度下孵育3分钟
• 加入50微升待测样品（或100微克蛋白）（注意：样品须清澈）
• 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
• 即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数（30分钟读数－0分钟读数）

• 计算样品活性

[（样品读数－背景读数）X样品稀释倍数X 1（体系容量；毫升）]÷[0.05（样品容量；毫升）X 13.6（毫摩尔吸光系数）X 30（反应时间；分钟）]＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克

单位＝微摩尔DMPTB/分钟

六、酶标仪测定

• 在96孔板上做好相应标记：背景对照和样品
• 分别移取205微升缓冲液（Reagent A）到所有孔里
• 加入25微升反应液（Reagent B）到样品孔里
• 加入25微升阴性液（Reagent D）到背景对照孔里
• 分别加入10微升底色液（Reagent C）到所有孔里
• 轻轻摇动96孔板
• 在37℃温度下孵育3分钟
• 分别加入10微升待测样品（或20微克蛋白）到所有孔里（注意：样品须清澈，且pH为7.2）
• 轻轻摇动96孔板
• 即刻放进酶标仪检测，包括（0分钟初始读数和30分钟读数）
• 活性计算

[（样品读数－背景读数）X样品稀释倍数X 0.25（体系容量；毫升）]÷[0.01（样品容量；毫升）X 13.6（毫摩尔吸光系数）X 0.6（光径距离；厘米）X 30（反应时间；分钟）]＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克

单位＝微摩尔DMPTB/分钟

注意事项

• 本产品为20次（96孔板，包括20次样品和20次背景对照）和5次（比色皿，包括5次样品和5次背景对照）操作
• 本产品检测范围是40至1600毫单位/毫升
• 建议血液样品采集后3小时内制备完成
• 操作时，须戴手套
• 每次样品测定，需要背景测定一次
• 样品须澄清，至关重要
• 样品中避免含有EDTA、TWEEN20、NP40、巯基乙醇、DTT等，否则干扰检测
• 孵育反应完成后即刻进行比色测定
• 比色测定后，比色皿须清洗彻底
• 建议待测样本的蛋白浓度为100微克/50微升（本公司提供  Bradford蛋白质浓度定量试剂盒30030.1）
• 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
• 酶活性单位浓度定义：在37℃下，pH 7.5的情况下，每单位酶在单位时间内（每分钟）水解1微摩尔三丁酸二巯基丙醇
• 正常脂肪酶的参考值：

小鼠血清809±15毫单位/毫升

大鼠血浆959±23毫单位/毫升

大鼠血清665±14毫单位/毫升

山羊血清44±1毫单位/毫升

牛血清80±1毫单位/毫升

人血清75±6毫单位/毫升

人血浆52±2毫单位/毫升

• 血液干扰因子如下：

未结合胆红素大于20毫克/分升

结合胆红素大于25毫克/分升

血红蛋白大于2000毫克/分升

甘油三酯大于1000毫克/分升

甘油大于250毫克/分升

抗坏血酸大于50毫克/分升

乳糜脂肪大于1%

• 本公司提供系列医学生化检测试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定检测敏感