重组腺病毒技术服务

理论支持：

本公司采用的是Adeasy系统，其基本原理是首先将目的基因克隆到穿梭质粒上，然后利用其与骨架质粒在BJ5183中的同源重组，得到携带目的基因的重组腺病毒质粒。将重组腺病毒质粒线性化后，能够在HEK293细胞中包装得到重组腺病毒。将得到的重组腺病毒鉴定后进行扩增，并采用氯化铯密度梯度离心得到纯化的重组腺病毒。

服务内容：

1、携带目的基因的重组腺病毒的制备；

2、携带多个目的基因的重组腺病毒的制备；

3、携带报告基因的重组腺病毒的制备（本公司提供携带绿色荧光蛋白基因和荧光素酶Luc^＋基因的重组腺病毒，还可根据客户需要进行制备）；

4、携带干涉序列的重组腺病毒的制备；

具体操作：

1、目的基因的获取：

   （1）特定细胞表达的目的基因：提取RNA后进行反转录，PCR扩增；

（2）载体中含有的目的基因：酶切或PCR获取；

（3）融合蛋白基因：根据需求，进行PCR合成目的基因；

2、穿梭质粒的构建：

（1）携带目的基因的穿梭质粒的构建：通过酶切、连接的方式得到，一般采用的是pShuttle-cmv载体；

（2）携带多个目的基因的穿梭质粒的构建：如同时表达两个目的基因，可通过IRES将两个目的基因相连；

（3）携带干涉序列shRNA的穿梭质粒：首先将H1启动子构建到pShuttle质粒上，然后将目的基因克隆到H1启动子下游；

3、重组腺病毒质粒构建：

携带目的基因的穿梭质粒线性化后与Adeasy-1共转BJ5183感受态细胞（电转），筛选得到重组腺病毒质粒，并经PacI酶切鉴定：可见目的质粒出现两条条带，分别为3.0kb或4.5kb和>23Kb两条条带。 将得到的重组腺病毒质粒转染DH5a感受态细胞，以便于保存。

4、重组腺病毒的制备：

将PacI酶切线性化的高纯度高浓度重组腺病毒质粒，以脂质体介导的方式转染293细胞，7～10天出现噬斑，待完全病变后，收集细胞和上清，于-70℃保存。

5、重组腺病毒的鉴定

在基因水平，提取腺病毒基因组DNA，采用目的基因的引物，PCR扩增病毒基因组DNA；并采用相应的引物，检测是否含有复制型腺病毒。

在蛋白水平，分泌蛋白，采用ELISA检测目的基因的表达；膜蛋白采用流式方法进行检测；其他蛋白采用Western-blot方法进行检测。

6、病毒扩增及纯化：

根据实验的需要扩增重组腺病毒（细胞实验20～40皿；动物实验60～80皿），并采用氯化铯密度梯度离心法进行纯化，纯化得到的病毒用10％甘油保存。

7、病毒滴度测定：

紫外分光光度法检测病毒的OD260和280值：根据OD260nm可推算病毒的颗粒滴度； OD260nm/OD280nm代表病毒的纯度。

同时，采用快速CPE和TCID50测定病毒的感染滴度。

服务承诺：

1、从得到cDNA到完成纯化的时间在60个工作日之内；

2、得到的纯化病毒纯度（OD260nm/OD280nm）在1.2~1.4之间，总量大于1×10¹⁰pfu；

3、提供详细的实验报告和重要的中间产物（重组腺病毒质粒和原始病毒）；

客户须知：

    1、客户如需要进行蛋白水平的鉴定，另行商议实验周期；

    2、实验周期不包含TCID50检测时间，一般需要10个工作日。

服务价格：

询价。