特别提示：包括无缝连接试剂盒在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：无缝连接试剂盒
英文名称：Seamless Ligation Kit
产品货号：MT0053
产品规格：10T|50T

本试剂盒是一种混合酶系统，其可将任意方法线性化的载体和与其两端具有重叠区域的一个或多个PCR片段定向重组连接。该方法不依赖于T4 DNA连接酶，不受载体和目的片段的酶切位点限制，可在30分钟内实现PCR片段高效定向无缝克隆至载体的任意位置，从而获得完整的双链DNA分子。该试剂盒使用简单，只需加入合适比例的载体和PCR片段在50℃孵育15～30分钟即可完成片段的连接。

产品组成：

组分	10T	50T
2×Gibson Assemble Mix	50μl	250μl

保存条件：20℃可保存2年，-80℃可保存5年，避免反复冻融。

产品特点：
1．不受载体或插入片段酶切位点限制在任意位置进行无缝克隆；
2．不依赖于T4连接酶，高效连接，无碱基缺失；
3．可同时高效连接一个或多个PCR片段；
4．无需额外的亚克隆，菌检阳性率高达95%。

工作原理：
1．T5外切酶可从双链DNA5"端切割形成3"突出末端， 从而促进重叠区域的具有互补序列的片段进行退火。
2．Super-Fidelity DNA聚合酶可使退火的片段向3"端延伸，从而填补片段缺口。
3．Taq DNA连接酶可封闭缺刻从而获得完整的双链DNA分子。


检测效果和应用实例：

1．KpnI/HindIII酶切pCold-sumo-M vector获得线性化载体，插入与载体有25nt同源臂的引物扩增Gp32基因（966bp），然后应用2×Gibson Assembly Mix连接线性化载体和Gp32，50℃孵育15分钟，然后取5μl连接产物转化DH5a感受态细胞，涂板过夜后菌检。其中左图为长斑情况对比，A为对照（不加片段）B为实验组（Gp32片段），右图为挑取32个斑进行PCR扩增后电泳，其中阳性检出率为31/32(~97%)。

2．PCR 扩增pCold-sumo-M vector获得线性化载体，插入与载体有15nt同源臂的引物扩增Bst基因（2.4kb），然后应用2×Gibson Assembly Mix连接线性化载体和Gp32，50℃孵育30分钟，然后取5μl连接产物转化DH5a感受态细胞，涂板过夜后菌检。其中左图为长斑情况对比，A为对照（不加片段）B为实验组（Gp32片段），右图为挑取40个斑进行PCR扩增后电泳，其中阳性检出率为40/40(~100%)。

3．KpnI/HindIII酶切pCold-sumo-M vector获得线性化载体，插入与载体有25nt同源臂的引物扩增Gp32基因（966bp），加入的载体与片段的摩尔比分别是1:1、1:2、1:3的长斑情况对比，其中1:3时长斑数量最多，三者菌检阳性率无显著差异。


线性化载体制备：
1．酶切获得：单酶切或双酶切均可获得线性化载体，选用的内切酶不同，载体会产生粘末端和平末端；酶切后的载体进行胶回收后再用于Gibson组装，这样有助于减少转化时因酶切不完全导致的假阳性克隆。建议使用双酶切，载体线性化完全，转化背景低。
2．PCR扩增获得：建议用超高保真DNA聚合酶（MT0051）进行 PCR 扩增载体片段， 获得的产物建议用凝胶回收纯化以降低转化后的假阳性克隆。在以载体为模板进行 PCR 扩增时，模板的量应控制在0.1-0.5ng/50μl 体系，从而降低转化背景。一般而言，凝胶回收后，非线性化载体已降低至一定程度，可以直接应用于Gibson组装。
  *建议通过 PCR 扩增获得线性化载体，这样可最大程度的降低转化背景（空载体），提高连接效率和转化阳性率。

插入片段制备：
应用超保真DNA聚合酶（MT0025）进行 PCR 扩增获得插入片段，获得的片段如产物单一条带可进行 PCR 产物纯化回收，否则进行凝胶回收以提高转化效率和克隆阳性率。插入片段的引物设计尤其值得注意，具体见下一部分。

引物设计：
插入片段的引物序列包括重叠序列部分和特异性部分。通过在引物 5’端引入线性化克隆载体末端的同源序列，是的插入片段的5"和 3"端分别带有与线性化克隆载体两端对应的完全一致的序列，重叠区域的长度一般为15-25nt，对于长片段可增加至 40nt 同源序列，特异性部分在18～25nt。

1. 单个插入片段的引物设计
 （1）线性化载体为酶切获得
  根据载体线性话方式不同，其末端结构包括 5"突出末端、3"突出末端和平末端三种形式，引物设计也分三种情况，示意如下：

 （2）线性化载体由 PCR 扩增获得
  线性化载体由反向PCR 扩增获得时，要求扩增载体的PCR 引物和扩增插入片段的对应 PCR 引物的重复序列在15～25nt之间。如只需连接一个基因，可将重复序列分配在载体和插入片段上（图5），这样引物易于优化；如需连接多个基因，为减少载体扩增次数，可将重复序列只设计在载体上（图6）。


2. 多个插入片段的引物设计
  多个插入片段引物设计原理同单片段，即相邻片段之间有 15-25nt的重叠区域， 设计引物时有两种方式（图7），一种为重叠区域分配在两个片段，另一种为重叠区域完全在其中一个片段上，设计如下图例：


操作步骤：
1. 取出2×Gibson Assemble Mix，放置于室温使其完全溶化或用手捂化，融化后轻弹混匀，再短暂离心，以免有贴在管壁或管盖上的造成损失。
2. 准备好线性化载体和插入片段，按照下表配制反应体系：
  线性化载体—————————10-50 ng
  插入片段——————————x*μl
  2×Gibson Assemble Mix———5μl
  灭菌水———————————up to 10μl
  * 注：线性化载体一般10-50ng/10μl反应体系，插入片段与载体的摩尔比为2～3:1最佳。
  DNA片段的摩尔数算法如下：
  pmols=(质量ng)×1000/(碱基数量×650)
  50ng of 5000bp 双链DNA片段相当于0.015pmol
  50ng of 500bp 双链DNA片段相当于0.15pmol
3. 轻轻混匀，于PCR仪上50℃孵育30分钟，反应产物用于转化或冻存于-20℃。对于短片段（<1kb)或1～2个片段，孵育时间可缩短至15分钟，对于较长片段或多片段连接，可延长孵育时间至60分钟，适当延长孵育时间可提高连接效果。
4. 取5～10μl连接产物转化克隆感受态细胞，涂板长斑后挑菌进行菌检，挑取至少3个克隆进行测序验证。

常见问题分析：
1.无克隆长出或克隆数较少
  可能原因如下：
 （1）引物设计不理想：根据15～25nt同源序列+18～25nt 基因特异性引物原则设计优化引物，引物GC含量在40～60%之间，Tm值＞50℃。
 （2）感受态细胞的效价过低：使用的感受态细胞效价要>10⁶cfu/μg,操作时可设置转化质粒的实验对照，以排除因感受态细胞的效价过低引起的失败。
 （3）线性化克隆载体与插入片段的使用量过少或比例不佳：按照上述操作步骤中建议的量配制反应体系，载体一般使用量为 10～50ng，插入片段与载体的摩尔比为 2-3:1最佳，如比例严重不合适会降低转化效率。
 （4）线性化载体或插入片段未进行纯化抑制连接反应：线性化载体无论是酶切获得还是 PCR 扩增获得，都建议进行凝胶回收后在用于Gibson组装，插入片段PCR扩增后，如未经纯化，体积不要超过总反应体积的20%。
2. 出现较多假阳性（空载体)
 （1）克隆载体酶切不完全或PCR扩增时加入模板过量：未完全切开的载体会导致转化背景，即假阳性克隆，可通过提高限制性内切酶使用量、延长酶切反应时间、胶回收纯化酶切产物来降低未切开载体导致的假阳性。
 （2）PCR扩增克隆载体时，每50μl体系模板的量控制在0.1～5ng，否则也会导致转化背景过多。
3. 克隆测序后片段不正确
 （1）PCR 产物混有非特异扩增产物：建议对PCR产物进行切胶回收，保证回收的条带为正确的单一条带。
 （2）酶切不完全：如线性化载体时不是由空载体酶切或扩增，而是由已插入其他片段的载体酶切或扩增制备而来，酶切不完全会导致克隆中插入不正确的片段，因此提高酶切效率或使用预线性化质粒作为模板或载体凝胶回收都可降低此种情况的发生。

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货号	名称	规格
BTN100103A	裂殖酵母化学感受态细胞制备试剂盒	20次
BTN140384	农杆菌GV3101化学感受态细胞	10×100μL
BTN120699	多粘菌素B硫酸盐	5mL
BTN120696	土霉素盐酸盐溶液	10mL
YT001	质粒小量抽提试剂盒	50次|200次
YT463	C端BFP标签融合蛋白质粒(蓝色荧光蛋白)	1μg
WE0249	TA快速连接试剂盒(pUC-T)	20次

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名称：大肠杆菌DH5α化学感受态细胞
货号：BTN81024
规格：0.1mL*10
 本产品是采用大肠杆菌DH5α菌株经特殊工艺处理得到的感受态细胞，可用于DNA的热击转化。DH5α是一种常用于质粒克隆的菌株，其φ80lacZΔM15基因产物可与载体编码的β-半乳糖苷酶氨基端实现α互补，可用于蓝白斑筛选。recA1和endA1的突变有利于克隆DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。使用pUC19质粒检测，转化效率不低于107，适用于高效的质粒DNA克隆并能保证高拷贝质粒的稳定复制。
 本菌种来源于Hoffman-Berling 1100菌种。
 

基因型	表现型
deo R	组成型合成脱氧核糖
end A1	核酸内切酶I缺失
gyr A96	具有萘啶酮酸抗性
hsd R17	限制性酶EcoK缺失
△(lac)U169	lac基因缺失
rec A1	DNA重组活性降低
Rel A1	允许在无蛋白质合成时有RNA合成
sup E44	抑制琥珀突变突变，为某些噬菌体必需
thi-1	不能自身合成硫氨
φ80(lac ZΔM15)	提供α-互补所需的ω片断

储存条件：干冰运输、-80℃保存，有效期半年。

使用方法：
1. 取感受态细胞置于冰浴中。一次转化感受态细胞的建议用量为50-100μl，可以根据实际情况分装使用。
以下实验以50μL感受态细胞为例。
2. 待感受态细胞融化后，向感受态细胞悬液中加入目的DNA(根据实际情况加入适量的DNA，通常100μl感受态细胞能够被1ng超螺旋质粒DNA所饱和)，用移液器轻轻吹打混匀，冰浴30分钟。
3. 42℃热击90秒，迅速将离心管转移到冰浴中，冰上静置2-3分钟。
4. 每个离心管中加入800μl无菌的SOC或LB培养基(不含抗生素)，混匀后置于37℃摇床，200rpm(小于225rpm)振荡培养45分钟使菌体复苏。
5. 根据实验需求，取适量已转化的感受态细胞，加到含相应抗生素的SOC或LB固体琼脂培养基上，用无菌的涂布棒将细胞均匀涂开，将平板置于37℃直至液体被吸收，倒置培养，37℃培养12-16小时。
注意事项：
1、涂布用量可根据具体实验调整。若转化的DNA总量较多，可取少量转化产物涂布平板；若转化的DNA总量较少，可取200-300μl转化产物涂布平板。若预计的克隆数较少，可通过离心(4,000rpm ，2分钟)后吸除部分培养液，悬浮菌体后将其涂布于平板中。
2、新制备的固体培养基不易涂干，可将平板正置于37℃直至液体被吸收后再倒置培养。
3、涂布剩余的菌液可置于4℃保存，如果次日的转化菌落数过少，可以将剩下的菌液再涂布新培养基进行培养。