特别提示：包括人葡萄球菌荧光定量PCR试剂盒(染料法)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：人葡萄球菌荧光定量PCR试剂盒(染料法)
英文名称：Staphylococcus hominis qPCR Kit(Dye Method)
产品货号：BTN14-32115
产品规格：50次



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货号	名称	规格
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名称：胸膜肺炎放线杆菌荧光定量PCR试剂盒(染料法)
货号：BTN14-42600
规格：50次
胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)是一种呼吸道寄生菌，主要存在于患病动物的肺部和扁桃体，病猪和带菌猪是本病的主要传染源。本病的感染途径是呼吸道，即通过咳嗽、喷嚏喷出的分泌物和渗出物而传播，而接触传播可能是其主要的传播途径。国内外的研究及临床实践表明，猪患呼吸系统疾病时，容易发生继发感染或混合感染。如本病与猪伪狂犬、兰耳病、多杀性巴氏杆菌、肺炎霉形体、嗜血杆菌等病原的混合感染，应引起高度重视，因此快速检测胸膜肺炎放线杆菌具有重要意义。荧光定量PCR是检测传染性疾病的主流技术，本产品就是以染料法荧光定量PCR技术为基础开发的专门检测胸膜肺炎放线杆菌的试剂盒。

试剂盒特点：
1．即开即用，用户只需要提供DNA模板。
2．特异性高，引物是根据人胸膜肺炎放线杆菌高度保守区设计,不会扩增其他细菌。
3．引物和扩增体系经过优化，灵敏性比常规PCR高100倍。
4．提供无传染性的PCR阳性对照，便于区分假阴性样品。
5．一管式操作，荧光PCR检测，不容易产生环境污染。
6．本产品只能用于科研，本试剂盒足够50次20μL体系的PCR。

试剂盒组成：

组分	规格
2×qPCR MagicMix	0.5mL（棕色）
荧光PCR专用模板稀释液	1 mL（亮黄盖）
胸膜肺炎放线杆菌PCR引物混合液	100 μL（白盖）
胸膜肺炎放线杆菌PCR阳性对照 (1×108拷贝/μL)	50 μL（红盖）
核酸释放剂试用装	20次（1mL，绿盖）

有效期：-20℃保存，有效期一年。

自备试剂：DNA模板、10×ROX（根据机型决定，具体见使用方法）。

使用方法：

一、制备标准曲线样品（以10²-10⁷拷贝/μL这6个10倍稀释度为例）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。
1．标记6个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。
2．用带芯枪头分别加入45 μL荧光PCR专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。
3．在7号管中加入5 μL阳性对照（其浓度为1×10⁸拷贝/μL，试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10⁷拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
4．换枪头，在6号管中加入5 μL 1×10⁷拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10⁶拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
5．换枪头，在5号管中加入5 μL 1×10⁶拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10⁵拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
6．重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品DNA的制备
7．用自选方法纯化样品的DNA，本产品跟市场上绝大多数核酸纯化产品兼容。
8．如果有N个样品，则需要进行N+2个样品提取，多出的一个用作样品制备阳性对照管、另一个用作样品制备阴性对照管。本试剂盒免费赠送20次免DNA提取的天净沙核酸释放剂试用装，该释放剂的裂解液可以直接作为PCR模板，省略了DNA提取步骤。

三、设置qPCR反应（20μL体系，在样品制备室进行）
9．如果进行定量分析，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照，6个用于标准曲线样品。如果做定性分析，则6个标准曲线样品只选一个做（可以选4号，其余样品不变）。以下只介绍定量分析的反应设置。
10．在标记管中按下表加入各成分：
  

成分	N+2个样品管	PCR阴性对照管	标准曲线样品管 （2-7管）
2×qPCR MagicMix	10 μL	10 μL	各10 μL
胸膜肺炎放线杆菌PCR引物混合液	2 μL	2 μL	各2 μL
自备10×ROX(见注)	2 μL	2 μL	各2 μL
N+2个待测样品DNA模板	6 μL	不加	不加
自备超纯水	不加	6 μL	不加
第7步所得标准曲线 样品稀释液（2-7号）	不加	不加	各6μL （2号样到2号管， 3号样到3号管…）

  注：仅ABI7500、7700和7900仪器需要使用ROX作为对照，其他荧光PCR仪器（如iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene 3000、RotorGene 6000和LightCycler480）不需要使用ROX，则用水替代。
11．盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR（具体PCR参数可以根据仪器不同而自行优化）。

四、荧光定量PCR反应参数

过程	温度	时间
预变性	94℃	5min
PCR反应（40个循环）	94℃	30s
	50℃	30s（采集SYBR通道的荧光信号）
	72℃	30s
最后延伸	72℃	10min

五、数据处理
12．设12.定60℃-96℃范围的融解曲线分析，排除假阳性。
13．如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再推算出其浓度。
14．如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于30。对待测样品，如果其Ct大于或等于40则为阴性，如果小于或等于35则为阳性。如果在35-40之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性，如果小于40，则为阳性。