特别提示：包括细胞膜染色试剂DiO在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：细胞膜染色试剂DiO
产品货号：HR8623
产品规格：500μl

DIOC16(3)PERCHLORATE 细胞膜染色试剂为绿色荧光标记的细胞膜探针，具有488 / 500nm的最大激发/发射波长。
当亲脂性的绿色荧光探针DIOC16(3)PERCHLORATE 进入细胞膜后，在整个细胞膜上扩散，最佳浓度时可以使整个细胞膜染色。染色液DIOC16(3)PERCHLORATE在进入细胞膜之前荧光非常弱，当与细胞膜结合后其荧光强度大大增强，被激发后可以发出绿色的荧光，具有很高的淬灭常数和激发态寿命。
荧光探针DIOC16(3)PERCHLORATE 通常不会明显影响细胞的活力，因此被广泛用于正向或逆向的，活的或固定的神经等细胞或组织的示踪剂。除了最简单的细胞膜荧光标记外，还可以用于检测细胞的融合和粘附，检测发育或移植过程中细胞迁移，通过FRAP(Fluorescence Recovery After Photobleaching)检测脂在细胞膜上的扩散，检测细胞毒性和标记脂蛋白等。
细胞膜探针具有多种颜色可以选择，可根据情况对样品进行多色标记实验。除了本试剂盒的绿色荧光探针，我公司还可以提供红色、橙色、深红色等颜色的染色试剂盒。
以96孔板每孔200μl染色液计，本试剂盒小包装可以染色1000-5000个样本。

储存条件：染料-20℃避光保存；避免反复冻融。
有效期：六个月。

※ ※ ※ 使用前请仔细阅读产品说明书 ※ ※ ※
使用限制：本试剂盒仅供科学研究使用，不可用于诊断或治疗。
产品更新：我公司会更新或升级产品，以优化和增强其使用性能，产品说明书会进行相应的版本更新。使用产品时，请参照随产品附带的说明书，不要参照网上下载的说明书，可能是不同的版本。需要最新电子版说明书时可以在收到产品后发邮件索取。
使用安全：使用时需要合适的实验室外套，一次性手套。避免皮肤或粘膜与试剂接触。如果试剂不小心接触皮肤或眼睛，应立即用水冲洗。

注意事项：
● 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖和管内壁上的液体离心至管底，避免开盖时试剂损失。
● 禁止与其他品牌的试剂混用，否则会影响使用效果。
● 样品或试剂被细菌或真菌污染或试剂交叉污染可能会导致错误的结果。
● 最好使用一次性吸头、管、瓶或玻璃器皿，可重复使用的玻璃器皿必须在使用前清洗并彻底清除残留清洁剂。
● 实验后完成后所有样品及接触过的器皿应按照规定程序处理。
检测方法：
流式细胞仪
荧光显微镜
激光共聚焦
样本类型：
● 悬浮细胞
● 贴壁细胞
试剂盒以外自备仪器和试剂耗材：
仪器
●离心机 ●荧光显微镜/流式细胞仪 ● 移液器 ●冰箱 ●冰盒
耗材
●离心管 ● 吸头
试剂
● PBS(pH7.4，实验室常用的10mM磷酸缓冲盐溶液)或者HBSS

使用方法：

使用注意事项：
● 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。
● DIOC16(3)PERCHLORATE染色液为DMSO溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。
● 使用前，先将本品取出回温至室温，并对其进行简短离心使DMSO溶液集中于管底。
● 细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。
●标记的条件因细胞种类而异，根据不同样本的实际染色结果做相应调整，在每次实验前，请先根据不同的实验要求、细胞类型、细胞的膜通透性等进行优化，确定最佳条件。以下方法仅供参考。
●染色后立即进行分析。
●本染色液可用于细胞涂片、细胞的检测。
一、染色工作液的配制：
1．根据样本数量，用37℃培养箱预热的HBSS 将DIOC16(3)PERCHLORATE荧光染料400-2000倍稀释，配制成染色工作液。
【注】:
● 也可以直接用相应的无血清培养基或其他缓冲液稀释DIOC16(3)PERCHLORATE染料至所需浓度。
● 开始实验前，使用无血清培养基或HBSS缓冲液稀释染料储存液到需要的工作浓度。工作浓度应根据不同细胞的预实验结果确定的最佳工作浓度，建议至少在超过10倍范围的浓度下进行测试。一般染色终浓度400-2000倍稀释，1000-2000倍适合大多数细胞样本。
● 建议收到产品后，根据单次使用量，对母液进行小量分装，每次使用一管，试剂-20℃避光冻存，一年稳定。
● 工作液现配现用。
● 为了降低探针加载过度可能引起的假阳性，建议在不影响染色效果的情况下尽量使用低浓度。
● 若细胞在染色后于不含染料的培养基中孵育，荧光信号会衰减。
二、细胞染色
A：悬浮细胞染色
1．用PBS洗涤细胞2次。
2．加入适量体积的染色工作液重悬细胞，使其密度大约为1×106/mL。
3．在37℃孵育细胞 5～20分钟，不同的细胞最佳培养时间不同。可以用20分钟作为起始孵育时间，之后优化体系以得到均一的标记结果。
【注】:
● 若染色不够充分，建议增加染料浓度或延长染色时间。
4．孵育结束，500 g离心5分钟。
5．倾倒上清液，再次缓慢加入37℃预热的培养液重悬细胞。
6．重复(4)，(5)步骤两次以上
B：贴壁细胞染色
1．用PBS 洗涤细胞2次。
2．细胞培养板中或细胞爬片上加入适量体积的染色工作液。
【注】:
● 96孔细胞培养板每孔加入100μl染色液即可。
3．37℃孵育细胞 5～20分钟，不同的细胞最佳培养时间不同。可以用20分钟作为起始孵育时间，之后优化体系以得到均一的标记结果。
【注】:
● 若染色不够充分，建议增加染料浓度或延长染色时间。
4．吸干染色工作液，用培养液洗培养板或盖玻片2～3次，每次用预热的培养基覆盖所有细胞，孵育5～10分钟，然后吸干培养基。
三、用荧光显微镜或流式细胞仪检测
最大激发波长为488nm，最大发射波长为500nm。

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储存条件及有效期：室温密封保存，有效期36 个月，开瓶后有效期为12 个月。试剂一应用液和试剂二应用液配好后若本次实验未用完，需-20℃冰箱冷冻避光保存。下次实验临用前，需平衡到室温再使用。
试剂二应用液如在配制完成后留有红色，可以加入少量活性炭粉，过滤后使用。

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胞质内的酸性磷酸酶在酸性条件下，磷酸萘酚AS-BⅠ被细胞内酸性磷酸酶(acid phosphatase，ACP)水解产生萘酚AS-BⅠ，再与重氮盐偶联，形成不溶性有色沉淀。
本试剂盒适用于细胞涂片、细胞爬片、血涂片、骨髓涂片、冰冻切片及石蜡切片等的染色。阳性反应为鲜红色或深红色颗粒，定位于胞浆当中。

储存条件：2-8℃密封保存。
有效期：三个月。工作液现用现配，一次用完。

注意事项：
1．使用前请仔细阅读说明书。
2．所有的工作液请使用前新鲜配制，配制后立即使用，一次使用完。
3．石蜡切片不需要固定。
4．水洗后不要太干即放入孵育液中孵育，太干后染色效果会变差。
5．用底物孵育液孵育时要注意避光。
6．如果样本为骨片的石蜡切片，不可用酸脱钙法脱钙，酸脱钙对蛋白质酶类的影响较大，使细胞中的特异性酶失活，从而影响特异性的酶染色，导致酶不能跟底物结合，会使染色失败。请使用其他对蛋白质的影响小的脱钙方法。

使用方法：
工作液的配制：
1．底物反应液一配制：使用前用移液器将试剂B 吸入试剂A中，溶解混匀，配成甲液；将试剂D 吸入试剂C中，溶解混匀，配成乙液。将甲液和乙液混匀即成底物反应液一。
2．底物反应液二配制：使用前用移液器将试剂F 吸入试剂E中，溶解混匀，即成底物反应液二。
3．底物孵育液的配制：在染色缸中加入 30ml 蒸馏水，37℃水浴10分钟。将底物反应液一、二、三依次加入已预温的蒸馏水中混合并充分混匀。
4．将样本玻片固定，水洗后还未完全干前，立即放入已准备好的底物孵育液中避光孵育60分钟。
5．新鲜血涂片、细胞涂片爬片、冰冻切片用固定液固定2-10分钟。石蜡切片脱蜡后不需要再固定。
样本的染色处理：
一、血涂片及骨髓涂片
1．推片：取全血或骨髓3μl 左右置载玻片上，将推玻片保持与载玻片30°角，置于血滴正前方，稍微往后移与血滴接触，血滴沿推片下缘散开，再匀速沿载玻片平面平稳向前滑动，至血滴铺完血膜为止。不要太薄，以免细胞太少，也不要太厚，以免太重叠。
2．固定：让涂片在空气中自然晾干，再放入本试剂盒中的固定液中固定2-3分钟，水洗30-60秒。
3．孵育：水洗后还未完全干前放入底物孵育液中避光孵育60分钟。太干后染色效果会变差。
4．复染：孵育完后，取出水洗1分钟，在玻片未完全干前进行复染。可用苏木素复染1-2分钟，或者用甲基绿复染2-3分钟，两者任选其一即可。
二、细胞涂片及细胞爬片
1．固定：将细胞涂片或细胞爬片放入本试剂盒中的固定液中固定2-3分钟，水洗30-60秒。
2．孵育：水洗后还未完全干前放入底物孵育液中避光孵育60分钟。太干后染色效果会变差。
3．复染：孵育完后，取出水洗1分钟，在玻片未完全干前进行复染。可用苏木素复染1-2分钟，或者用甲基绿复染2-3分钟，两者任选其一即可。
三、冰冻切片
1．回温：将保存在-20℃冰箱中的冰冻切片放置到切片架上回温5-10分钟。可以放在37℃孵箱中进行回温，或者将切片架放置在一个小盒子中，将盒子置于37℃水浴锅中进行回温。
2．水合：将回温好的切片，水中浸泡1-2分钟。
3．固定：让切片在空气中自然晾干，再放入本试剂盒中的固定液中固定2-3分钟，水洗30-60秒。
4．孵育：水洗后还未完全干前放入底物孵育液中避光孵育60分钟。太干后染色效果会变差。
5．复染：孵育完后，取出水洗1分钟，在玻片未完全干前进行复染。可用苏木素复染1-2分钟，或者用甲基绿复染2-3分钟，两者任选其一即可。
四、石蜡切片
1．脱蜡：二甲苯中脱蜡5-10分钟。再换用新鲜的二甲苯脱蜡5-10分钟。
2．无水乙醇浸泡5分钟。再分别用90%、70%乙醇各2分钟。
3．水合：蒸馏水中浸泡2分钟。
4．孵育：还未完全干前放入底物孵育液中避光孵育60分钟。太干后染色效果会变差。
5．复染：孵育完后，取出水洗1分钟，在玻片未完全干前进行复染。可用苏木素复染1-2分钟，或者用甲基绿复染2-3分钟，两者任选其一即可。

结果分析：
阳性反应为鲜红色或深红色颗粒，定位于胞浆中。