特别提示：包括钙黄绿素红色衍生物在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：钙黄绿素红色衍生物
英文名称：Red Calcein Acetoxymethyl ester
产品货号：KM0178
产品规格：1mg

Calcein,AM是一种具细胞膜渗透性最受欢迎的活细胞荧光染料，用来标记和监测活细胞功能，呈绿色荧光（Ex/Em= 490nm/515nm）。然而，Calcein,AM单一颜色使其不能将其用在多重标记实验，比如，其无法和GFP转染细胞联合使用，因光谱一致。为了解决这一应用缺陷，我司特别开发出Red Calcein,AM，实现联合Calcein,AM对活细胞的标记和功能分析。

同样原理，Red Calcein,AM自身无荧光，具有细胞膜渗透性。一旦进入细胞后，被细胞内酯酶水解为红色钙黄绿素（Red Calcein），能与胞内钙离子结合，产生强烈的红色荧光（Ex/Em=560/574），用标准的TRITC/Cy3滤片设置检测。

主要参数：
分子量：1015.79
纯度：≥90%（HPLC）
Ex/Em：560/574nm
溶解性：溶于DMSO（1~5mM）
保存：-20℃干燥保存，避免强光直射，有效期一年。

注意事项：
1．荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。
2．乙酰氧基甲基酯（AM）易吸潮，冰箱取出后请在干燥的环境放至室温后再开封。由于试剂微量，开封前请将其短暂离心，以保证粉末落入管底。
3．Red Calcein,AM对湿度非常敏感，粉末保存一定要保持干燥。Red Calcein,AM储存液需要分装避光冻存，且必须紧紧密封盖子，干燥保存。Red Calcein,AM工作液必须现配现用。
4．为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法：

一、储存液制备
储存液配制范围可为1～5 mM，具体根据工作浓度来决定，建议提前配制成1000×储存液。若使用的工作液为5μM，那么可配制5mM的储存液，即往1mgCalcein Red AM（Mw：1015.79）内加入196μl细胞培养级别的DMSO（货号：KM0186）即可。储存液需要根据单次用量分装，-20℃避光干燥保存，一定要避免受潮，此种情况下可稳定保存数月。

二、20%Pluronic F-127制备（可选）
称取100mgPluronic F-127粉末（货号：KM0188）中加入500μl DMSO，配制成20%(w/v)DMSO母液。溶解过程需要在40-50℃加热20-30min。溶液室温保存，不用冷藏。如有结晶析出，可以重新加热后溶解，不影响使用。

三、染色步骤
大多数实验体系中Red Calcein,AM的工作浓度为2-5μM。由于不同细胞系的最佳染色条件不同，初次实验建议做梯度实验，以确定Red Calcein,AM的最佳工作浓度，以最低的探针浓度得到最好的荧光结果为筛选原则。
1．取一管适量分装的储存液（1000×）置于室温，至少回温20min，低速离心后，用合适的缓冲液如PBS，HBSS-HEPES稀释到1×染色工作液。
  注意：有时可添加一定量的非离子表面活性剂如Pluronic F127到Red Calcein,AM储存液内来增强其水溶性。制备染色工作液前，取一管Red Calcein,AM储存液内加入等体积的20%Pluronic F127，使Pluronic F127的终浓度为0.02%。加入Pluronic F127的Red Calcein,AM溶液不可长期保存，需现配现用。
2．对于贴壁细胞，先用胰酶-EDTA消化细胞，离心收集细胞（1000rpm，3min）。对于悬浮细胞，直接离心收集细胞。
3．去上清，用PBS（或者其他缓冲液）清洗细胞2~3次，以充分去除残留的酯酶活性。
4．用1/10细胞培养基体积的Red Calcein,AM染色工作液重悬细胞，37℃孵育20min～1h。
  注意①：若细胞自身含有机阴离子转运体，需加入丙磺舒（1-2.5mM）或者苯磺唑酮（0.1-0.25mM）到孵育体系内以降低去酯化的Red Calcein泄露到胞外；
  注意②：降低探针加载温度，可能会减少探针区室化现象。
5.用PBS（或者其他缓冲液）洗涤细胞两次去除多余染料。
  注意：如有必要，使用含有机阴离子转运抑制剂的缓冲液来进行细胞清洗；
6．用含合适滤光片（Ex/Em= 560nm/574nm）的仪器进行检测。

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外观：深绿色结晶性粉末
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