特别提示：包括CCK8细胞增殖与毒性检测试剂在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：CCK8细胞增殖与毒性检测试剂
英文名称：CCK8 cell proliferation and toxicity test reagents
产品货号：MT0102
产品规格：100次(1ml)|500次(1ml×5)

本制品是一种基于WST-8的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性检测的试剂，因其操作简单快速、高灵敏度且细胞毒性低等成为替代MTT法检测细胞生长密度的最好方法。该试剂盒利用水溶性四唑盐-WST-8在电子载体1-Methoxy PMS存在的情况下能够被还原成水溶性的甲臜染料，生成的甲臜量与活细胞数量成正比。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。本制品广泛应用于细胞增殖测定、细胞毒性测定、药物筛选、肿瘤药敏试验等。

产品特点：
·灵敏度高，数据重复性好；
·操作简单，安全性高；
·细胞毒性低，无需放射性同位素；
·单一组分，无需配制。

应用实例：

接种96孔板293T细胞，每孔加入10μl CCK-8溶液，混合均匀，在37℃，5% CO2培养箱中培养，酶标仪读取不同培养时间的OD值，做标准曲线。

操作方法：

一、细胞计数测定
1．96孔培养板中贴壁或悬浮细胞100μl/孔培养体积(>2000个细胞/孔)。
2．向每孔加入10μl的CCK- 8溶液（注意不要在孔中生成气泡，它们会影响O.D值的读数)。如果起始的培养体积为200μl，则需加入20μl CCK-8溶液。
  注意：加了相应量细胞培养液和CCK-8溶液，但没有加入细胞的孔作为空白对照。
3．将培养板在培养箱内孵育1-4小时。
4．用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。
5．如果暂时不测定O.D值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入10μl 1% w/v SDS溶液或者0.1M HCl溶液，并遮盖培养板避光保存。在24小时内吸光度不会发生变化。

二、细胞增殖实验和细胞毒性检测
1．96孔培养板中贴壁或悬浮细胞100μl/孔培养体积(＞5000个细胞/孔)。
2．向培养板加入10μl不同浓度的待测药物。
3．将培养板在培养箱孵育一段适当的时间（例如:6,12,24或48小时)。
4．向每孔加入10μl CCK-8溶液(注意不要在孔中生成气泡，它们会影响O.D值的读数)。
5．将培养板在培养箱内孵育1～4小时。
6．用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
7．如果暂时不测定O.D值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入10μl 1%w/v SDS溶液或者0.1M HCl溶液，并遮盖培养板避光保存。在24小时内吸光度不会发生变化。

三、制作标准曲线（需要测定细胞绝对数量时)
1．先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞。
2．按比例(例如1:2的比例)依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做3～5个细胞浓度梯度，每组3～6个复孔。
3．接种后培养使细胞贴壁，然后加CCK-8试剂培养一定时间后测定O.D值，制作出一条以细胞数量为X轴，O.D值为Y轴的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量（使用此标准曲线的前提条件是实验的条件要一致)。

注意事项：
1．接种时注意细胞悬液一定要混匀，以避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不等，可以每接种几个孔就混匀一下。培养板周围一圈孔培养基容易挥发，为了减少误差，建议培养板的四边每孔只加培养基或PBS，而不作为指标检测孔。
2．本制品的检测依赖于脱氢酶催化的反应，如果待检测体系中存在较多的还原剂，例如一些抗氧化剂会干扰检测，需设法去除。
3．用酶标仪检测前需确保每个孔内没有气泡，否则会干扰测定。
4．培养时间根据细胞种类的不同和每孔内细胞数量的多少而异。一般情况下，白细胞较难染色，因此需要较长的培养时间或增加细胞数量（~10⁵个细胞/孔)。悬浮细胞与贴壁细胞相比较难染色。对于悬浮细胞，在培养1～4小时后，可先从培养箱中取出，目察染色程度或用酶标仪测定决定。若染色困难，可将培养板放回培养箱，继续培养数小时后再确定。 染色的最佳时间可定为悬浮细胞的最佳培养时间。对于贴壁细胞，培养时间一般为1～4小时，但在培养30分钟左右即可取出肉眼观察染色程度（根据细胞种类而定，需要摸索一下条件)。
5．若细胞培养时间较长，培养基颜色发生变化或pH发生变化，建议更换新鲜的培养基后再加CCK-8试剂。

保存条件：-20℃避光可保存2年，融化后 4℃避光放置可保存 1 年。反复冻融会增加背景值。

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BTN131230 DNase I干粉 100mg
WE0212 蛋白酶K 100mg
SV0145 BmtI-HF限制性内切酶 1500U|300U
SV0170 BsaXI限制性内切酶 500U|100U
SV0269 BstYI限制性内切酶 10KU|2KU
SV0365 EcoRV-HF RE-Mix限制性内切酶 200次
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名称：末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT酶)
货号：YT512
规格：500U
本酶是一种模板依赖的DNA聚合酶，可以催化在寡核苷酸、单链或双链DNA的3"羟基端加上dNTP。可以催化的寡核苷酸的最短长度为3个核苷酸。

用途：寡核苷酸或DNA 3"羟基末端标记；DNA末端加尾(DNA tailing)；5"-RACE；合成同一种脱氧核苷酸的寡聚链等。
来源：由大肠杆菌表达，表达基因的来源为小牛胸腺。
活性定义：37℃60分钟内，催化1nmol dNTP加入到多聚核苷酸3"羟基末端中所需的酶量定义为1个活性单位。
酶活性检测条件：200mM potassium cacodylate(pH7.2),1mM CoCl2,0.1mM DTT,0.01%(v/v)Triton X-100,10μM oligo(dT)10,1mM dTTP and 0.4MBq/ml[3H]-dTTP。
纯度：不含DNA内切酶和外切酶，不含RNase。
酶储存溶液：100mM KAc(pH6.8),2mM 2-mercaptoethanol,0.01%(v/v)Triton X-100 and 50%(v/v)glycerol 。
Reaction Buffer(5X)：0.125M Tris(pH7.2 at 25℃),1M potassium cacodylate,0.05%(v/v)Triton X-100,5mM CoCl2。
失活或抑制：70℃加热10分钟或加入适量EDTA均可导致Terminal Deoxynucleotidyl Transferase失活。金属离子螯合剂，较高浓度的铵根离子、氯离子、碘离子和磷酸根均对Terminal Deoxynucleotidyl Transferase有抑制作用。
储存条件：-20℃。

使用说明：

1. DNA 3’末端标记：
a. 参考如下表格设置反应体系：
待标记DNA————————————————————10 pmol of 3"-termini
Reaction Buffer (5X) ——————————————10µl
[α-32P]-ddATP, ~10TBq/mmol (3000Ci/mmol)————1.85 MBq (50µCi)
TdT (20U/µl) ——————————————————2µl
补充无核酸酶的去离子水 —————————————至50µl
b. 按上表设置好反应体系后，轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用 Vortex在最低速度轻轻混匀)，随后离心沉淀液体。
c. 37℃孵育15分钟。
d. 70℃孵育15分钟或加入5µl 0.5M EDTA终止反应。
说明：标记的效率和3’羟基末端的类型有关，3’突出末端的标记效率要显著高于3’缩进末端或平末端的标记效率。

2. DNA末端加尾(DNA Tailing)：
a. 参考下表格设置反应体系：
DNA片段 ————————————————————1 pmol of 3"-termini
Reaction Buffer (5X)——————————————4µl
dATP or dTTP——————————————————130pmol
或 dGTP or dCTP (四种中通常只需加入一种)————60pmol
TdT (20U/µl)——————————————————1.5µl
补充无核酸酶的去离子水—————————————至20µl
b. 按上表设置好反应体系后，轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用 Vortex在最低速度轻轻混匀)，随后离心沉淀液体。
c. 37℃孵育15分钟。
d. 70℃孵育15分钟或加入5µl 0.5M EDTA终止反应。
说明：在上述反应条件下，每个3’羟基末端可以加上100-130个dA或dT，或20-30个dC或dG。

3. 其他用途可以参考上述用途或适当的文献资料进行。