鸭乙型肝炎病毒探针法荧光定量PCR试剂盒

中英文名称	规格	价格	说明书
Duck Hepatitis B Virus(DHBV) 鸭乙型肝炎病毒探针法荧光定量PCR试剂盒	50次	3490元	咨询
运输：低温 保存：负20度 有效期：一年 货期：2-3周

产品及特点
1. 即开即用，用户只需要提供样品 DNA 模板。
2. 引物和探针经过优化，灵敏性高。
3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
4. 特异性高，引物是根据鸭乙型肝炎病毒高度保守区设计，不会跟其他病毒的DNA 发生交叉反应。
5. 本产品足够 50 次 20μL 体系的探针法荧光定量 PCR 反应。
6. 本产品只能用于科研。
规格及成分

成分 编号 十孔盒包装 2×Probe qPCR MagicMix YB190303 0.5 mL（本色盖） 荧光 PCR 专用模板稀释液YB 180701 1 mL（黄盖） 鸭乙型肝炎病毒探针法 qPCR引物混合液 YB15-44200yw 100 μL（白盖） 鸭乙型肝炎病毒 qPCR 探针 YB15-44200pb 50 μL（棕色管） 鸭乙型肝炎病毒探针法 qPCR阳性对照(1×10E8 拷贝/μL)YB60908-44200pc50 μL（黄盖） 核酸释释剂试用装 YB61202 20 次（1mL，绿盖） 使用手册YB 15-44200sc 1 份

实验操作
1. 模板制备（样本制备区）
建议使用配套水生动物病害基因组 DNA/RNA 提取试剂盒系列产品，具体过程详见产品说明书。
2．添加模板（模板添加区，放置于冰盒中进行）
请于-20℃条件下保存，有效期 12 个月
取出所需测试数的已含有反应液 A-TSV-I 的 PCR 管，将试剂完全解冻，离心 30 秒，在管盖上标记管名（阴性对照管 NG、样品 XX、阳性对照管 PG）。打开管盖向各管管底分别加入 0.8μL B-I 及 0.2μL R-I，盖上阴性对照管管盖，其他各管分别沿管壁加入 2μL 模板，顺序为待测样品模板、PG-TSV-I，依次盖好各管管盖，离心 30 秒，立即进行扩增反应。
3. 扩增反应（扩增及产物分析区）
①恒温仪器 63℃条件下反应 60 min。待仪器升温至 63℃后，新建程序，设置实验名称及反应时间，将步骤 2中离心后的 PCR 反应管放入恒温荧光分子检测仪，点击开始检测。
②若使用荧光定量 PCR 仪，则荧光基团选择 FAM，淬灭基团选择 None，将 63℃ 15 s，63℃ 45 s 作为一个循环，于 63℃ 45 s 处收集荧光信号，60 个循环。
其他仪器请参照仪器说明书进行设置。
设置qPCR反应（20 μL体系，在样品制备室进行）
10. 如果只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照，6个用于PCR阳性对照。如果做2-3次重复，则反应设置数量相应增加2或3倍。
11. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后加）：

成分 样品管 N+2 个 PCR 阴性 对照管 标准曲线 样品管（2-7 管） 2×Probe qPCR MagicMix 10 μL 10 μL 各 10 μL 鸭乙型肝炎病毒 qPCR 探针 1 μL 1 μL 各 1 μL 鸭乙型肝炎病毒探针法 qPCR 2 μL 2 μL 各 2 μL 引物混合液 N+2 个待测样品 DNA 模板 7 μL 不加 不加 超纯水 不加 7 μL 不加 第 7 步所得标准曲线样品稀释液 （2-7 号） 不加 不加 各 7μL（2 号样到 2 号管，3 号样到 3 号管…）

盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR（具体PCR参数可以根据仪器不同而自行优化）。

过程 温度 时间 预变性 95℃ 5 min PCR 反应 （40 个循环） 95℃ 15sec 60℃ 60 sec（采集 FAM 通道的荧 光信号）

数据处理
如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再推算出其浓度。
如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于30。对待测样品，如果其Ct大于或等于40则为阴性，如果小于或等于35则为阳性。如果在35-40之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性，如果小于40，则为阳性。
分区之间最好进行物理性隔离，避免人为因素造成的污染。
2．实验过程中穿戴工作服和乳胶手套，不同区域独立使用工具，需更换手套和实验服。
3．严格按照操作步骤操作，试剂配制和加样等步骤请严格按照说明书要求在冰盒上操作。
4．反应液中的成分对光敏感，应避光保存。试剂使用前要完全解冻，但应避免反复冻融，推荐使用前离心 30秒。
5．反应结束后，扩增管请置于密封袋内丢弃，当日清理，开盖易造成气溶胶污染，禁止开盖。
6．不同批号试剂请勿混合使用，在有效期内使用。
反应五要素：
参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。设计引物应遵循以下原则：
①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。
②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC*随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列*有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以*引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。