特别提示：包括口蹄疫病毒通用RT-PCR试剂盒在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！ 
产品名称：口蹄疫病毒通用RT-PCR试剂盒
英文名称：Foot-and-Mouth Disease Virus(FMDV)
产品规格：50次

口蹄疫病毒通用RT-PCR试剂盒产品及特点: 
因此快速灵敏检测口蹄疫病毒通用具有重要意义。本产品就是为此目的根据 RT-PCR原理开发的试剂盒，
它具有下列特点：
1. 一站式，用户不需要单独准备每种成分，包括引物和对照。
2. 根据口蹄疫病毒的保守基因序列设计的引物，具有良好的特异性。
3. 灵敏度可以达到 1000 拷贝/反应。
4. 使用一管式 RT-PCR 技术，RT 和 PCR 两步在一个试管内完成，不需要中间
转移样品，降低了操作误差和可能的污染。
5. 本产品足够 50 次 20μL 体系的 RT-PCR。
6. 本产品只能用于科研，不能用于临床。
口蹄疫病毒通用RT-PCR试剂盒规格及成分:

成 份 编号 十孔盒包装 5×双酶一管式 RT-PCR Buffer YB91202a 200 μL（橘黄盖） MMLV-Taq Mix YB91202b 75 μL（红盖） 超纯水 YB100935 1 mL（亮黄盖） 口蹄疫病毒通用 RT-PCR引物混合液YB 13-17700yw 100 μL（白盖） 口蹄疫病毒通用 RT-PCR阳性对照（1×10E8 拷贝/μL）YB13-17700pc 50 μL（黄盖） 核酸释放剂（试用装）YB 61202a 20 次（1mL，绿盖） 使用手册 YB13-17700sc 1 份

运输及保存：低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。收到货后阳性对照需要跟其他成分 分开放置，因为其容易污染其他成分，造成假阳性。
自备试剂：样品 DNA。
口蹄疫病毒通用RT-PCR试剂盒使用方法：
一、样品 DNA 的制备
1. 如果有 N 个样品，必须设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性对照），一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用口蹄疫病毒通用 PCR 阳性对照的 1000 倍稀释液作为制备的阳性对照。可以用水作为制备的阴性对照。制备所得成为样品 RNA。
2. 用自选方法纯化 N+2 个样品的 RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒 RNA 提取试剂盒兼容。本试剂盒免费赠送 20 次天净沙核酸释放剂试用装，
二、设置 RT-PCR反应（40μL 体系）
3. 对 N+2 个样品，在 RT-PCR时需要增加一个 RT-PCR阳性对照和一个 RT-PCR阴性对照，故需要设置 N+4 个反应。在 N+4 个 RT-PCR管中分别加入下列成分：

成份 N+2 个样品管RT-PCR阴性对照RT-PCR阳性对照 5×双酶一管式 RT-PCR Buffer 各 4 μL 4 μL 4 μL 口蹄疫病毒通用 RT-PCR 引物混合液 各 2 μL 2 μL 2 μL N+2 个制备的 RNA 样品 各 12.5 μL - - 超纯水 - 12.5 μL - 口蹄疫病毒通用 RT-PCR 阳性对照 的 1000 倍稀释液 - - 12.5 μL MMLV-Taq Mix 1.5 μL 1.5 μL 1.5 μL

4. 按下表设置 RT-PCR反应：

过程 温度 时间 逆转录 42℃ 30 min 预变性 95℃ 5 min PCR 反应（35 个循环）95℃ 30 sec58℃ 30 sec72℃ 30 sec 延伸 72℃ 7 min

三、电泳检测
5. 取 10-20 μL RT-PCR产物。电泳检测 RT-PCR产物。本产品提供的 RT-PCRMix在扩增结束后可以直接上样，不需要另外再加 loading buffer。RT-PCR产物阳性对照必须有预期条带出现，阴性对照必须无任何扩增，否则实验无效。对没有扩增产物的样品，可以稀释 10 倍后重复 RT-PCR扩增以排除 RT-PCR抑制剂的感染。
RT-PCR常见问题的常见原因
1. cDNA产量的很低可能的原因：
1) RNA模板质量低
2）对mRNA浓度估计过高
3）反应体系中存在反转录酶抑制剂或反转录酶量不足
4）同位素磷32过期
5）反应体积过大，不应超过50μl
2. 扩增产物在电泳分析时没有条带或条带很浅
1) 最常见的原因在于您的反应体系是RT-PCR的反应体系而不是RT-RT-PCR的反应体系
2）与反应起始时RNA的总量及纯度有关
3）建议在试验中加入对照RNA
4）第一链的反应产物在进行RT-PCR扩增时，在总的反应体系中的含量不要超过1/10
5）建议用Oligo(dT)或随机引物代替基因特异性引物（GSP）用于第一链合成。由于RNA模板存在二级结构，如环状结果，有可能导致GSP无法与模板退火；或SSⅡ反转录酶无法从此引物进行有效延伸。
6）目的mRNA中含有强的转录中止位点，可以试用以下方法解决：
a. 将第一链的反应温度提高至50℃。
b. 使用随机六聚体代替Oligo(dT)进行第一链反应。
3. 产生非特异性条带
1) 用RT阴性对照检测是否被基因组DNA污染。如果RT阴性对照的RT-PCR结果也显示同样条带，则需要用DNase I重新处理样品。
2) 在RT-PCR反应中，非特异的起始扩增将导致产生非特异性结果。在低于引物Tm 2至5℃的温度下进行退火，降低镁离子或是目的DNA的量将减少非特异性结果的产生。
3) 由于mRNA剪切方式的不同，根据选择引物的不同将导致产生不同的RT-RT-PCR结果。
4. 产生弥散（smear）条带
1) 在RT-PCR反应体系中第一链产物的含量过高
2) 减少引物的用量
3) 优化RT-PCR反应条件/减少RT-PCR的循环次数
4) 在用DNase处理被DNA污染的RNA样品时，其产生的寡核苷酸片段会产生非特异性扩增，一般会显示为弥散背景。
5. 产生大分子量的弥散条带
1) 大多数情况下是由于退火温度过低而导致的非特异性的起始及延伸产生的
2) 对于长片段的RT-PCR，建议将反应体系中cDNA的浓度稀释至1:10（或1:100-1:200）
6. 在无反转录酶的情况下，对照RNA获得扩增结果