淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒RT-PCR试剂盒
产品名称：淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒RT-PCR试剂盒
英文名称：Lymphocytic Choriomeningitis Virus(LCMV)
产品规格：50次
淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒RT-PCR试剂盒产品及特点:
因此快速灵敏检测淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒具有重要意义。本产品就是为此目的根据 RT-PCR原理开发的试剂盒，
它具有下列特点：
1. 即开即用，用户只需要提供 DNA 模板。
2. 引物经过精心优化，专一性强，只扩增淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒，与其他植物没有交叉反应。
3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
4. RT-PCRmix 中含上样染料，RT-PCR后可以直接上样电泳。
5. 本试剂盒足够做 40μL 体系的 RT-PCR50 次，但只能用于科研。
淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒RT-PCR试剂盒规格及成分:
| 成分 | 编号 | 十孔盒包装 |
| RT-PCRMagicMix 3.0 | 1 | 1 mL（红盖） |
| 超纯水 | 2 | 1 mL（亮黄色） |
| 淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒RT-PCR引物混合液 | 3 | 100 μL（白盖） |
| 淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒RT-PCR阳性对照 （1×10E8 拷贝/μL） |
4 | 50 μL（黄盖） |
| 核酸释放剂（试用装） | 5 | 20 次（1 mL，绿盖） |
| 使用手册 | 6 | 1 份 |
自备试剂：样品 DNA。
淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒RT-PCR试剂盒使用方法：
一、样品 DNA 的制备
1. 用自选方法纯化 N+2 个样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数核酸提取试剂盒兼容。本试剂盒免费赠送20 次核酸释放剂试用装，其使用手册可以从本公司网站订购核酸释放剂。
2. 如果有 N 个样品，则需要做 N+2 个提取，包括一个样品制备阳性对照和一个样品制备阴性对照。样品制备阳性对照是在适量水（取决于试剂盒要求的样品起始量）中加 10μL 淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒 RT-PCR阳性对照的 1000 倍稀释液而得，样品制备阴性对照是直接用水。提取结束后最后得到模板 DNA 放冰上待用。
二、设置 RT-PCR反应（40μL 体系）
3. 对 N+2 个样品，在 RT-PCR时需要增加一个 RT-PCR阳性对照和一个 RT-PCR阴性对照，故需要设置 N+4 个反应。在 N+4 个 RT-PCR管中分别加入下列成分：
| 成分 | N+2 个样品管 | RT-PCR阴性对照 | RT-PCR阳性对照 |
| RT-PCRMagicMix 3.0 | 各 20 μL | 20 μL | 20 μL |
| 淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒RT-PCR引物混合液 | 各 2 μL | 2 μL | 2 μL |
| N+2 个样品 DNA 模板 | 各 18 μL | -- | -- |
| RT-PCR阴性对照（水） | 6 μL | 18 μL | -- |
| RT-PCR阳性对照（淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒 RT-PCR阳性对照的 1000 |
-- | -- | 18 μL |
| 倍稀释液） | -- | -- |
| 过程 | 温度 | 时间 |
| 预变性 | 95℃ | 5 min |
| RT-PCR反应（30个循环） | 95℃ | 15 sec |
| 57℃ | 15 sec | |
| 72℃ | 40 sec | |
| 最后延伸 | 72℃ | 10 min |
5. 取 10-20 μL RT-PCR产物。电泳检测 RT-PCR产物。本产品提供的 RT-PCRMix在扩增结束后可以直接上样，不需要另外再加 loading buffer。RT-PCR产物阳性对照必须有预期条带出现，阴性对照必须无任何扩增，否则实验无效。对没有扩增产物的样品，可以稀释 10 倍后重复 RT-PCR扩增以排除 RT-PCR抑制剂的感染。
RT-PCR常见问题的常见原因
1. cDNA产量的很低可能的原因：
1) RNA模板质量低
2）对mRNA浓度估计过高
3）反应体系中存在反转录酶抑制剂或反转录酶量不足
4）同位素磷32过期
5）反应体积过大，不应超过50μl
2. 扩增产物在电泳分析时没有条带或条带很浅
1) 最常见的原因在于您的反应体系是RT-PCR的反应体系而不是RT-RT-PCR的反应体系
2）与反应起始时RNA的总量及纯度有关
3）建议在试验中加入对照RNA
4）第一链的反应产物在进行RT-PCR扩增时，在总的反应体系中的含量不要超过1/10
5）建议用Oligo(dT)或随机引物代替基因特异性引物（GSP）用于第一链合成。由于RNA模板存在二级结构，如环状结果，有可能导致GSP无法与模板退火；或SSⅡ反转录酶无法从此引物进行有效延伸。
6）目的mRNA中含有强的转录中止位点，可以试用以下方法解决：
a. 将第一链的反应温度提高至50℃。
b. 使用随机六聚体代替Oligo(dT)进行第一链反应。
3. 产生非特异性条带
1) 用RT阴性对照检测是否被基因组DNA污染。如果RT阴性对照的RT-PCR结果也显示同样条带，则需要用DNase I重新处理样品。
2) 在RT-PCR反应中，非特异的起始扩增将导致产生非特异性结果。在低于引物Tm 2至5℃的温度下进行退火，降低镁离子或是目的DNA的量将减少非特异性结果的产生。
3) 由于mRNA剪切方式的不同，根据选择引物的不同将导致产生不同的RT-RT-PCR结果。
4. 产生弥散（smear）条带
1) 在RT-PCR反应体系中第一链产物的含量过高
2) 减少引物的用量
3) 优化RT-PCR反应条件/减少RT-PCR的循环次数
4) 在用DNase处理被DNA污染的RNA样品时，其产生的寡核苷酸片段会产生非特异性扩增，一般会显示为弥散背景。
5. 产生大分子量的弥散条带
1) 大多数情况下是由于退火温度过低而导致的非特异性的起始及延伸产生的
2) 对于长片段的RT-PCR，建议将反应体系中cDNA的浓度稀释至1:10（或1:100-1:200）
6. 在无反转录酶的情况下，对照RNA获得扩增结果
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