特别提示：包括伊氏锥虫探针法荧光定量PCR试剂盒在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！ 
产品名称：伊氏锥虫探针法荧光定量PCR试剂盒
英文名称：Trypanosoma evansi
产品规格：50次

伊氏锥虫探针法荧光定量PCR试剂盒产品及特点: 
因此快速灵敏检测伊氏锥虫探针法荧光定量具有重要意义。本产品就是为此目的根据 PCR 原理开发的试剂盒，
它具有下列特点：
1. 即开即用，用户只需要提供样品 DNA 模板。
2. 引物和探针经过优化，灵敏性高。
3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
4. 特异性高，引物是根据伊氏锥虫高度保守区设计，不会跟其他寄生虫的 DNA 发生交叉反应。
5. 本产品足够 50 次 20μL 体系的探针法荧光定量 PCR 反应。
6. 本产品只能用于科研。
伊氏锥虫探针法荧光定量PCR试剂盒规格及成分:

成分 编号 十孔盒包装 2×Probe qPCR MagicMix YB190303 0.5 mL（本色盖） 荧光 PCR 专用模板稀释液 YB180701 1 mL（黄盖） 伊氏锥虫探针法qPCR引物混合液 YB15-66070yw 100 μL（白盖） 伊氏锥虫 qPCR 探针 （5 μM） YB15-66070pb 50 μL（棕色管） 伊氏锥虫探针法 qPCR 阳性对照 (1×10E8 拷贝/μL) YB60908-66070pc 50 μL（黄盖） 核酸释释剂试用装 YB61202 20 次（1mL,绿盖） 使用手册 YB15-66070sc 1 份

运输及保存：低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。
自备试剂：样品 DNA。
伊氏锥虫探针法荧光定量PCR试剂盒使用方法：
一、样品 DNA 的制备
1. 用自选方法纯化 N+2 个样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数核酸提取试剂盒兼容。本试剂盒免费赠送20 次核酸释放剂试用装，其使用手册可以从本公司网站订购核酸释放剂。
2. 如果有 N 个样品，则需要做 N+2 个提取，包括一个样品制备阳性对照和一个样品制备阴性对照。样品制备阳性对照是在适量水（取决于试剂盒要求的样品起始量）中加 10μL 伊氏锥虫探针法荧光定量 PCR 阳性对照的 1000 倍稀释液而得，样品制备阴性对照是直接用水。提取结束后最后得到模板 DNA 放冰上待用。
二、设置 PCR 反应（40μL 体系）
3. 对 N+2 个样品，在 PCR 时需要增加一个 PCR 阳性对照和一个 PCR 阴性对照，故需要设置 N+4 个反应。在 N+4 个 PCR 管中分别加入下列成分：

成分 样品管 N+2 个 PCR 阴性 对照管 标准曲线 样品管 （2-7 管） 2×Probe qPCR MagicMix 各 10 μL 10 μL 各 10 μL 伊氏锥虫 qPCR 探针 各 1 μL 1 μL 各 2 μL 伊氏锥虫探针法 qPCR 引物混合 液 各 2 μL 2 μL 各 2 μL 待测样品 DNA 模板 各 6 μL 不加 不加 超纯水 不加 6 μL 不加 第 7 步所得标准曲线样品稀释液 （2-7 号） 不加 不加 各 6μL（2 号 样到 2 号管，3 号样到 3 号 管…）

4. 按下表设置 PCR 反应：

过程 温度 时间 预变性 95℃ 5 min PCR 反应 （40 个循环） 95℃ 0.5 min 55℃ 0.5 min（采集 FAM 通道的荧 光信号） 72℃ 0.5 min

三、电泳检测
5. 取 10-20 μL PCR 产物。电泳检测 PCR 产物。本产品提供的 PCR Mix在扩增结束后可以直接上样，不需要另外再加 loading buffer。PCR 产物阳性对照必须有预期条带出现，阴性对照必须无任何扩增，否则实验无效。对没有扩增产物的样品，可以稀释 10 倍后重复 PCR 扩增以排除 PCR 抑制剂的感染。
PCR常见问题的常见原因
1. cDNA产量的很低可能的原因：
1) RNA模板质量低
2）对mRNA浓度估计过高
3）反应体系中存在反转录酶抑制剂或反转录酶量不足
4）同位素磷32过期
5）反应体积过大，不应超过50μl
2. 扩增产物在电泳分析时没有条带或条带很浅
1) 最常见的原因在于您的反应体系是PCR的反应体系而不是RT-PCR的反应体系
2）与反应起始时RNA的总量及纯度有关
3）建议在试验中加入对照RNA
4）第一链的反应产物在进行PCR扩增时，在总的反应体系中的含量不要超过1/10
5）建议用Oligo(dT)或随机引物代替基因特异性引物（GSP）用于第一链合成。由于RNA模板存在二级结构，如环状结果，有可能导致GSP无法与模板退火；或SSⅡ反转录酶无法从此引物进行有效延伸。
6）目的mRNA中含有强的转录中止位点，可以试用以下方法解决：
a. 将第一链的反应温度提高至50℃。
b. 使用随机六聚体代替Oligo(dT)进行第一链反应。
3. 产生非特异性条带
1) 用RT阴性对照检测是否被基因组DNA污染。如果RT阴性对照的PCR结果也显示同样条带，则需要用DNase I重新处理样品。
2) 在PCR反应中，非特异的起始扩增将导致产生非特异性结果。在低于引物Tm 2至5℃的温度下进行退火，降低镁离子或是目的DNA的量将减少非特异性结果的产生。
3) 由于mRNA剪切方式的不同，根据选择引物的不同将导致产生不同的RT-PCR结果。
4. 产生弥散（smear）条带
1) 在PCR反应体系中第一链产物的含量过高
2) 减少引物的用量
3) 优化PCR反应条件/减少PCR的循环次数
4) 在用DNase处理被DNA污染的RNA样品时，其产生的寡核苷酸片段会产生非特异性扩增，一般会显示为弥散背景。
5. 产生大分子量的弥散条带
1) 大多数情况下是由于退火温度过低而导致的非特异性的起始及延伸产生的
2) 对于长片段的PCR，建议将反应体系中cDNA的浓度稀释至1:10（或1:100-1:200）
6. 在无反转录酶的情况下，对照RNA获得扩增结果