特别提示：包括火鸡星状病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！ 
产品名称：火鸡星状病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒
英文名称：Turkey Astrovirus(TAstV)
产品规格：50次

火鸡星状病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒产品及特点: 
因此快速灵敏检测火鸡星状病毒染料法荧光定量具有重要意义。本产品就是为此目的根据 RT-PCR原理开发的试剂盒，
它具有下列特点：
1.一站式，用于不需要单独准备每种成分，包括引物和对照。
2.根据火鸡星状病毒的保守基因序列设计的引物，具有良好的特异性。
3.基于染料法qRT-PCR检测，灵敏度比常规RT-PCR高10-100倍，可以达到至少1000拷贝/反应。
4.使用一管式qRT-PCR技术，RT和PCR两步在一个试管内完成，不需要中间转移样品，降低了操作误差和可能的污染。
5.本产品足够50次30μL体系的RT-PCR，只能用于科研，不能用于临床。
火鸡星状病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒规格及成分:

成  份    编号    十孔盒包装 2×qRT-PCR 缓冲液    YB190101a    500 μL（棕色管） 10×qRT-PCR酶混合液    YB190101b    100 μL（红盖）  ROX染料I    YB190101c    50 μL（棕色管） ROX染料II    YB190101d    50 μL（棕色管） 荧光PCR专用模板稀释液    YB180701    1mL（亮黄盖） 火鸡星状病毒RT-PCR引物混合液    YB14-54400yw    100 μL（白盖） 火鸡星状病毒RT-PCR阳性对照（1×10E8拷贝/μL）    YB14-54400pc    50 μL（黄盖） 核酸释放剂试用装    YB61202    20次（1mL，绿盖） 使用手册    YB14-54400sc    1份

运输及保存：低温运输，-20℃保存，保存期限为12个月。阳性对照需要因易污染其他成分需要单独放置。本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供RNA片段作为阳性对照。
自备试剂：样品 DNA。
火鸡星状病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒使用方法：
一、样品 DNA 的制备
1. 用自选方法纯化 N+2 个样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数核酸提取试剂盒兼容。本试剂盒免费赠送20 次核酸释放剂试用装，其使用手册可以从本公司网站订购核酸释放剂。
2. 如果有 N 个样品，则需要做 N+2 个提取，包括一个样品制备阳性对照和一个样品制备阴性对照。样品制备阳性对照是在适量水（取决于试剂盒要求的样品起始量）中加 10μL 火鸡星状病毒染料法荧光定量 RT-PCR阳性对照的 1000 倍稀释液而得，样品制备阴性对照是直接用水。提取结束后最后得到模板 DNA 放冰上待用。
二、设置 RT-PCR反应（40μL 体系）
3. 对 N+2 个样品，在 RT-PCR时需要增加一个 RT-PCR阳性对照和一个 RT-PCR阴性对照，故需要设置 N+4 个反应。在 N+4 个 RT-PCR管中分别加入下列成分：

成分    N+2个制备所得样品    RT-PCR阴性对照    RT-PCR阳性 对照（2-7管） 2×qRT-PCR 缓冲液    10μL    10μL    各10μL 口蹄疫病毒RT-PCR 引物混合物    2μL    2μL    各2μL 50×ROX (见注)    0.4μL    0.4μL    各0.4μL  样品制备所得RNA模板（来于第8步）    5.6μL    不加    不加 稀释所得6个阳性对照（来于第6步）    不加    不加    各5.6μL（2号样到2号管，3号样到3号管…） 10×qRT-PCR酶混合液    2μL    2μL    2μL

4. 按下表设置 RT-PCR反应：

过程    温度    时间 RT（逆转录）    50℃    15-30分钟 预变性    94℃    2分钟 RT - PCR反应 （30个循环）    95℃    15 秒     60℃    15 秒（采集FAM通道的荧光信号）     72℃    15 秒 按仪器预设程序进行溶解曲线分析

三、电泳检测
5. 取 10-20 μL RT-PCR产物。电泳检测 RT-PCR产物。本产品提供的 RT-PCRMix在扩增结束后可以直接上样，不需要另外再加 loading buffer。RT-PCR产物阳性对照必须有预期条带出现，阴性对照必须无任何扩增，否则实验无效。对没有扩增产物的样品，可以稀释 10 倍后重复 RT-PCR扩增以排除 RT-PCR抑制剂的感染。
RT-PCR常见问题的常见原因
1. cDNA产量的很低可能的原因：
1) RNA模板质量低
2）对mRNA浓度估计过高
3）反应体系中存在反转录酶抑制剂或反转录酶量不足
4）同位素磷32过期
5）反应体积过大，不应超过50μl
2. 扩增产物在电泳分析时没有条带或条带很浅
1) 最常见的原因在于您的反应体系是RT-PCR的反应体系而不是RT-RT-PCR的反应体系
2）与反应起始时RNA的总量及纯度有关
3）建议在试验中加入对照RNA
4）第一链的反应产物在进行RT-PCR扩增时，在总的反应体系中的含量不要超过1/10
5）建议用Oligo(dT)或随机引物代替基因特异性引物（GSP）用于第一链合成。由于RNA模板存在二级结构，如环状结果，有可能导致GSP无法与模板退火；或SSⅡ反转录酶无法从此引物进行有效延伸。
6）目的mRNA中含有强的转录中止位点，可以试用以下方法解决：
a. 将第一链的反应温度提高至50℃。
b. 使用随机六聚体代替Oligo(dT)进行第一链反应。
3. 产生非特异性条带
1) 用RT阴性对照检测是否被基因组DNA污染。如果RT阴性对照的RT-PCR结果也显示同样条带，则需要用DNase I重新处理样品。
2) 在RT-PCR反应中，非特异的起始扩增将导致产生非特异性结果。在低于引物Tm 2至5℃的温度下进行退火，降低镁离子或是目的DNA的量将减少非特异性结果的产生。
3) 由于mRNA剪切方式的不同，根据选择引物的不同将导致产生不同的RT-RT-PCR结果。
4. 产生弥散（smear）条带
1) 在RT-PCR反应体系中第一链产物的含量过高
2) 减少引物的用量
3) 优化RT-PCR反应条件/减少RT-PCR的循环次数
4) 在用DNase处理被DNA污染的RNA样品时，其产生的寡核苷酸片段会产生非特异性扩增，一般会显示为弥散背景。
5. 产生大分子量的弥散条带
1) 大多数情况下是由于退火温度过低而导致的非特异性的起始及延伸产生的
2) 对于长片段的RT-PCR，建议将反应体系中cDNA的浓度稀释至1:10（或1:100-1:200）
6. 在无反转录酶的情况下，对照RNA获得扩增结果