钙通量分析是筛选G蛋白偶联受体（GPCR）药物发现的首选方法。该比值钙测定试剂盒允许均匀测量由G蛋白偶联受体或钙通道激活引起的细胞内钙变化。表达通过钙传递信号的GPCR的细胞被Fluo-4 AM预加载，Fluo-4 AM可以穿过细胞膜。一旦进入细胞内，Fluo-4 AM的亲脂性封闭基团就会被非特异性细胞酯酶裂解，从而导致带负电荷的Fluo-4染料留在细胞内，并且与钙结合后其荧光会大大增强。当细胞被筛选化合物刺激时，受体信号释放细胞内钙，这大大增加了Fluo-4的荧光。此Screen Quest Fluo-4 免洗钙含量测定试剂盒提供了一种优化的测定方法，用于监测G蛋白偶联受体（GPCR）和钙通道。该测定可以使用96孔或384孔微孔板进行，并易于适应自动化。百萤生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的Screen Quest 免洗Fluo-4钙检测试剂盒 。

样品实验方案

简要概述

1. 在生长培养基中准备细胞
2. 添加Fluo-4 AM染料加载溶液（对于96孔板为100 µL /孔，对于384孔板为25 µL /孔）
3. 在37°C孵育1小时
4. 检测Ex / Em = 490/525 nm的荧光强度

溶液配制

储备溶液配制

1. Fluo-4 AM储备溶液：将200 µL DMSO加到Fluo-4 AM（组分A）的小瓶中，并充分混合。 注意：20 µL Fluo-4 NW储备液足以装满一块板。 如果将试管紧密密封，可以将未使用的Fluo-4 AM储备溶液等分，并在<-20℃下保存1个月以上。 避光并避免重复的冻融循环。

2.分析缓冲液（1X）：将1 mL的10XPluronic®F127 Plus（10 mL，组分B）加入9 mL的HHBS缓冲液（组分C）中，制成1X的测定缓冲液，并充分混合。 注意：10 mL 1X分析缓冲液足以用于一块板。 分装并在<-20℃下存储未使用的10XPluronic®F127 Plus（组分B）。 避光并避免重复的冻融循环。

工作溶液配制

Fluo-4 AM上染溶液：将20 µL Fluo-4 NW储备溶液添加到10 mL的1X分析缓冲液中并充分混合。 该工作溶液在室温下至少可稳定2小时。

实验步骤

1.将100 µL /孔（96孔板）或25 µL /孔（384孔板）的Fluo-4 AM染料加载溶液添加到细胞板中。

2.将染料加载板在细胞培养箱中孵育1小时，然后在室温下再孵育15至30分钟。 注意：如果测定需要37°C，请立即进行实验，而无需进一步室温孵育。

3.用HHBS或所需的缓冲液准备复合板。

4.通过检测Ex / Em = 490/525 nm的荧光强度运行钙通量测定法。

图示