基于珠和柱的分离方法在很大程度上依赖于亲和结合系统的速度和简便性。诸如链霉亲和素，抗体和凝集素之类的配体，既用于捕获特异性标记的靶标蛋白，又用于分离天然表达配体结合伴侣的细胞和生物分子。植物凝集素，例如伴刀豆球蛋白A（Con A）的独特糖结合特性，使其可用于标记和分离血清和细胞裂解物中的聚糖提呈细胞和糖蛋白。凝集素还被用于细胞粘附研究，以实现淋巴细胞活化，并探索基于碳水化合物的疗法。

我们的伴刀豆球蛋白A（Con A）包被的BioMag Plus微粒为从血清或细胞裂解物中分离出含有甘露糖基和葡萄糖基的糖蛋白和多糖，或研究其他凝集素/聚糖介导的过程提供了方便的方法。 BioMag Plus磁性颗粒形式可提供高表面积，支持轻松高效的分离。

产品特点

伴刀豆球蛋白A（Con A）共价修饰吸附于功能化的BioMag Plus颗粒表面，用于从血清和细胞提取物中分离糖蛋白。

Con A是一个104,000 Da的蛋白质，由四个相同的亚基组成，并根据pH值以活性二聚体或四聚体的形式存在。它的碳水化合物结合伙伴是在α-D-葡萄糖和α-D-甘露糖上的C-3，C-4和C-6位置未经过修饰的OH基团，以及蛋白质和肽的末端葡萄糖残基。 Con A凝集红细胞（RBC），与免疫球蛋白糖肽相互作用，并且是淋巴细胞有丝分裂原。它能结合某些细菌。

Con A结合是由金属离子介导的，可稳定其构象。每个结合位点都需要钙和锰离子，因此使用含有EDTA或其他金属螯合剂的缓冲液会导致碳水化合物结合能力的丧失。

使用方法

•1.5ml或2ml微量离心管

•哺乳动物血清：0.4ml 1:20 PBS稀释液/test

•结合缓冲液：1x PBS + 0.1％NaN3+ 1mM MgCl2+ 1mM MnCl2+ 1mM CaCl2（pH 7.4）

•洗涤缓冲液：1 x PBS + 0.1％NaN3+ 1mM MgCl2+ 1mM MnCl2+ 1mM CaCl2（pH 7.4）+ 0.1％Tween 20

•Con A颗粒洗脱缓冲液：5mM Tris (pH 8.0) + 0.15M NaCl +0.05% SDS + 1M Glucose

•带有一次性吸头的精密移液器，20-200µl，200- 1000µl移液范围

•微量离心管分离器：

BioMag Solo-Sep Microcentrifuge Tube Separator (Cat. # 8MB4112S)

BioMag Multi-6 Microcentrifuge Tube Separator (Cat. # 8MB4111S)

BioMag Multi-32 Microcentrifuge Tube Separator (Cat. # 84106S)

•涡旋振荡器和试管旋转器

建议研究人员在任何应用中均需要进行颗粒使用的优化。

1.通过用10mM PBS稀释1:20制备0.4ml血清样品。

2.将1ml BioMag Plus Con A颗粒转移到干净的微量离心管中。将试管放在磁铁上，以从溶液中分离出颗粒。小心地取出并丢弃溶液。

3.加入1ml结合缓冲液洗涤颗粒，混匀。

4.再重复1次颗粒清洗。最后一次洗涤后，除去上清液。

5.向步骤1的血清样品中添加0.1ml结合缓冲液。将样品添加至颗粒中，并通过颠倒或涡旋混合均匀重悬颗粒。

6.将样品放在试管旋转器上，在室温下混合10-30分钟。

7.从旋转器中取出样品，并将其置于磁力分离器中。小心去除澄清的上清液。

8.加入0.5毫升洗涤缓冲液洗涤颗粒。通过倒置或涡旋混合均匀混合。

9.重复步骤7-8。用0.5ml的洗涤缓冲液重悬颗粒，试管旋转器上5分钟。

10.重复步骤7-9。

11.将颗粒管装回磁选机上，小心除去上清液。

12.向颗粒中加入250µl洗脱缓冲液。混合试管以重悬颗粒，然后在室温下将试管放在旋转器上10-30分钟。

13.将颗粒管重新装在磁分离器上，小心地除去洗脱液，然后转移到干净的微量离心管中，以备后用或保存。

14.重复步骤12-13。洗脱液可合并并沉淀。将洗脱液存储在冰上以立即使用，或冷冻保存以长期存储。

图1：使用BioMagPlus Con A磁性颗粒对脱铁运铁蛋白的结合和洗脱。将分别来自1ml，0.5ml，0.25ml，0.125ml和0.05ml BioMagPlus Con A颗粒的样品洗脱液（泳道2-6）与5µl，10µl，20µl和30µl 的0.3 mg/ml脱铁转铁蛋白储备液的等分试样进行比较（泳道7-10） 。

1.避免使用含有EDTA或其他金属螯合剂的试剂，因为这会降低结合缓冲液的效力。

2.当分离敏感的糖蛋白时，可以使用蛋白酶抑制剂。

3.通过将洗脱温育时间增加到10分钟以上，以及通过将颗粒在200µl SDS-PAGE样品缓冲液中煮沸5分钟，然后从洗脱液中磁性分离颗粒，可以增加糖蛋白回收率。 （注意：煮沸可能会使某些凝集素脱离，也可能释放非特异性结合的蛋白质。）

4.在 4-20％Tris-甘氨酸SDS-PAGE电泳凝胶上跑洗脱样品，并使用GlycoGel染色试剂盒（Cat＃24693）对糖蛋白条带进行染色以进行可视化。

5.进行GlycoGel染色后，使用考马斯G250（1ml或2ml 0.5％考马斯G250配制在50％甲醇和10％乙酸中的）染色，以观察其他蛋白条带。

6.从血清样品中去除白蛋白和IgG可以改善低浓度糖蛋白的分离。如果需要，请使用ProMax Albumin Removal Kit (Cat. # 24351) 和/或ProMax Serum IgG Removal Kit (Cat. # 24352)。

规格参数

3ml 或 10ml Con A 包被的磁颗粒，配制在含有0.1%NaN₃的10mM PBS中

平均直径：1.0µm

浓度：5mg/ml

Con A结合：由测定A280决定

储存于4˚C。冷冻，干燥或离心BioMag可能会导致不可逆的聚集和结合活性的丢失。建议在使用前在无菌培养基中洗涤BioMag SelectaPure anti-Human CD11b颗粒以去除防腐剂。强烈建议使用磁性分离装置进行洗涤而不是离心方式。

该颗粒悬浮液包含NaN₃。NaN₃可能与铅和铜管反应生成爆炸性金属叠氮化物。处置材料后，用大量水冲洗以防止叠氮化物积聚。请参阅Safety Data Sheet以获取更多信息。

这些产品仅用于研究目的，并不能用于人类或体外诊断。

参考文献

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