样品制备
1 样品采集：病死或扑杀禽，取喉气管、脑、胸肌、心肌和肺等组织；待检活禽，用棉拭子取呼吸 道分泌物或排泄物，置于 50%甘油生理盐水中。2～8 ℃保存，送实验室检测。（要求送检病料新鲜， 严禁反复冻融。）
2  样品处理：每份样品分别处理。
2.1 组织样品处理：每份组织分别从三个不同的位置称取样品约 1g，用手术剪剪碎混匀后取 0.02 g 于研磨器中研磨，加入 1.5 mL 生理盐水继续研磨，待匀浆后转至 1.5 mL 灭菌离心管中，8000 rpm 离心 2 min，取上清液 100 µL 于 1.5 mL 灭菌离心管中。
2.2  阳性对照处理：取阳性对照 100 µL，置 1.5 mL 灭菌离心管中。
2.3  阴性对照处理：取阴性对照 100 µL，置 1.5 mL 灭菌离心管中。
操作步骤
1 病毒 RNA 的提取
1.1 取已处理的样品、阴性对照和阳性对照，分别加入裂解液 600 µL，充分颠倒混匀，室温静置 3～
5 min。
1.2  将液体吸入吸附柱中（吸附柱要套上收集管，吸取液体时尽量不要吸到悬浮杂质，以免离心时 堵塞吸附柱），13000 rpm 离心 30 s。
1.3  弃去收集管中液体，加入 600 µL 洗液，13000 rpm 离心 30 s。
1.4 重复步骤 1.3。
1.5 弃去收集管中液体，13000 rpm 空柱离心 2 min，以除去残留的洗涤液。
1.6  将吸附柱移入新的 1.5 mL 离心管中，向柱中央加入洗脱液 50 µL，室温静置 1 min，13000 rpm
离心 30 s，离心管中液体即为模板 RNA。
2 实时荧光 RT-PCR 操作
设被检样品、阴性对照和阳性对照总和为 N，每份总体积 20µL，反应体系配制如下：
 

试剂	体系
无菌无核酸酶水	2.3（N+1）µL
RT-PCR 反应液	10（N+1）µL
酶混合液	0.4（N+1）µL
荧光探针	2.3（N+1）µL

将以上配制的反应体系充分混匀后，分装每个反应管中各 15 µL。
分别取 5 µL 模板 RNA，加入相应反应管中，混匀并作好标记，其中 AIV-H7 荧光报告基团为 FAM，AIV-H5 为 HEX，淬灭基团均为 None（如果仪器没有 HEX 校正过，可暂时用 VIC 代替）。在 荧光 PCR 仪上进行以下反应：45 ℃ 15 min，95 ℃ 1min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，在每个循环第二步
（60℃ 35s）收集荧光信号，共 40 个循环。
结果判定
1 结果分析条件设定 阈值设定原则：阈值线设定于刚好超过阴性对照扩增曲线的最高点。不同仪器可根据仪器噪音
情况进行调整。
2  结果描述及判定
阳性对照 Ct 值≤30 并出现特定的扩增曲线，阴性对照无 Ct 值并且无特定扩增曲线，实验结 果成立；被检样品若 FAM 荧光信号 Ct 值≤30 并出现特定的扩增曲线为 H7 阳性；被检样品若 Hex 荧光信号 Ct 值≤30 并出现特定的扩增曲线为 H5 阳性；被检样品 30＜Ct＜35 并出现特定的扩增曲线， 需重新取样提取 RNA，扩增后进行结果判定，如仍是可疑，可判定为阳性；被检样品 Ct 值≥35 时， 超过本方法检测灵敏度范围，判定为阴性；对于某些未呈现 S 型曲线，但本底较高的样品，应为阴 性。