产品及特点
KOD DNA Polymerase 是从克隆有 Thermococcus kodakaraensis DNA
聚合酶基因的质粒在大肠杆菌中经诱导表达分离纯化而来。该酶所具有的超强 3’
→ 5’外切酶活性使得其扩增保真性比 Pfu DNA Polymerase 更高,保真性是 Taq
的约 50 倍,同时具有合成速度快的特点,聚合速度约为普通 Pfu DNA Polymerase
的 5 倍,Taq DNA Polymerase 的 2 倍,达到 100-138 bp/秒,可以在短时间内
获得高产量的扩增产物,特别适合于高保真地扩增 6 kb 以内的 PCR 产物,扩增所
得的 DNA 为平末端,可用于基因克隆、表达及突变分析等分子生物学实验。
规格及成分
成 份
编 号
塑料袋包装
KOD DNA 聚合酶 (5 U/uL)
101002a
50 uL
10×KOD DNA 聚合酶缓冲液
101002b
1.0 mL
使用手册
101002sc
1 份
运输及保存
低温运输,-20℃保存、有效期一年。
自备试剂
DNA 模板、引物、超纯水
使用方法
一、建议PCR条件(以50 μL反应体系为例)
注:实际操作中计算好需补加水的量后,建议先加水,然后按上述顺序添加其它成
分,最后添加KOD DNA聚合酶。最好在冰浴上混合PCR各种成分,防止KOD DNA
聚合酶降解引物和模板。待各成分充分混匀后,离心数秒,使反应混合物沉到管底。
然后将反应管置于PCR仪中进行扩增。
二、关于PCR条件的优化
成分
体积
终浓度
模板
-
<0.5μg
正向引物(10 μM)
1 μL
0.2 μM
反向引物(10 μM)
1 μL
0.2 μM
10×KOD DNA 聚合酶缓冲液
5 μL
1×
dNTP Mixture(10mM each)
1 μL
0.2 mM
KOD DNA 聚合酶
0.25-0.5 μL
(1.25-2.5U)
-
超纯水
补足到 50 μL
-1. 质粒或者噬菌体模板(模板量5-20 ng,循环参数如下表)
2. 基因组DNA和cDNA模板(基因组DNA模板量为50-100 ng,1-2 μL cDNA
(起始转录用的RNA为500 ng),循环参数如下表)
循环参数
目标 DNA
<2 kb
Step 1
94C 2 分钟
Step 2
94C 20-30 秒
Step 3
Ta 15-20 秒
Step 4
72C 20-60 秒
Step 5
72C 5 分钟
Repeat step 2-4 for 30-35 个循环
Ta= Tm - 5C
循环参数
目标 DNA
<1 kb
目标 DNA
<2 kb
目标 DNA
3-4 kb
目标 DNA
5-6 kb
Step 1
94C 2 分钟
94C 2 分钟
94C 2 分钟
94C 2 分钟
Step 2
94C 20 秒
94C 20 秒
94C 20 秒
94C 30 秒
Step 3
Ta 20 秒
Ta 20 秒
Ta 20 秒
Ta 30 秒
Step 4
72C 20 秒
72C 30 秒
72C 40 秒
72C 60 秒
Step 5
72C 5 分钟
72C 5 分钟
72C 5 分钟
72C 5 分钟
Repeat step 2-4 for 30-35 个循环
Ta= Tm-5C
相关资料
活性定义
1 U 指 75℃条件下,30 分钟内使 10 nmoles 的 dNTPs 掺入酸不溶性沉淀
物所需要的酶量。
问题解决
问题
可能的原因
解决方法
没有PCR产
物
设计的扩增靶序
列太长
设计稍短的扩增靶序列,以基因组DNA为模
板KOD适合扩增不超过2kb左右的产物,以
质粒和噬菌体DNA为模板适合扩增6 kb以
下的DNA。
PCR条带弥
散
没有在冰上混合
PCR反应液
KOD扩增延伸速
PCR 反应液应该在冰上混合,KOD DNA聚
合酶应该最后加,以防止KOD DNA聚合酶
降解引物和模板。度为1Kb/15-30
秒,具有比其它聚
合酶更快的延伸
速度延伸时间过
长,有时会有拖尾
弥散效应。
如出现拖尾效应,可缩短退火延伸时间或者
减少酶量。
低产量
模板为高GC含量
模板量太低
加入DMSO 2-5%,由于该酶的耐热性好,
在应用于GC 含量高的模板等以及易产生高
级结构的模板时,可在96℃以上进行变性。
提高模板量
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