iLine F PRO细胞在线实时监测分析系统
图1 iLine F Pro实时在线细胞监测分析系统
Ovizio Imaging System公司是全息细胞分析技术的全球领导品牌，该公司具有专利的双微分数字全息显微技术（Duoble Differential Digital Holographic Microscopy: D3HM)开辟了细胞成像分析的新纪元，被国外专业杂志评价为开创性技术。作为专业细胞全息分析的品牌，提供无与伦比的细胞形态学分析和实时3D成像技术，将开启细胞形态学分析新的研究领域。
该技术由比利时布鲁塞尔自由大学（UniversitéLibre de Bruxelles，微重力研究中心）数字全息摄影专业的科学家Frank Dubois教授和他的团队花了十多年的时间进行基础研究，其中成功在国际空间站（ISS）上完成两项科学实验，以证明即使在恶劣环境中，基于光学的数字全息显微镜仍能展现其可靠性和稳定性。2009年12月，拥有13项同族专利的Ovizio Imaging Systems诞生，OVIZIO今天有20位专业的专家专注于疫苗、细胞治疗和单克隆抗体(mAbs)等生物加工领域。
图2 细胞分析计数技术发展史
数字全息成像技术的技术基础是记录被测物体的相位和振幅（光强）信息，进而完成数字三维重构，此独特的技术可对悬浮细胞进行实时、无标记、非侵害的监测分析。传统的光学显微镜记录被观测物体的图像，但数字全息显微(DHM)可记被观测物的型态、相位、光学和强度四大面向的信息，应用这些数据即可以进行定量成像应用和自动化分析。可实现单个细胞的3D成像及360度观察，也可完成视野内所有细胞的同时3D成像。
图3 iLine F Pro激光全息影像技术原理
【细胞膜完整性不同或免疫磁珠遇光产生不同的光学信号；透过专利光学技术，捕获细胞全息影像；机器学习计算程序分辨细胞活性、免疫磁珠或细胞团块。】
Ovizio iLine F PRO可实时监测细胞关键质量属性(CQAs)，以细胞为基础让用户更了解整个培养过程。分析方法无须染剂也无须手动采样，iLine F PRO可自动连续监控细胞生长状态。另外，透过BioConnect连接生物反应器形成封闭系统，可降低污染风险同时减少人力操作。
图4 iLine F Pro实时在线细胞监测分析系统工作示意图
系统通过机器学习算法(Machine Learning)进行细胞监测，可连续追踪多种细胞参数，例如：细胞活性、磁珠数量、细胞活化、细胞感染状态等。用户界面友好的OsOne软件集成了远程监控和自动化功能，借以改善细胞监测。iLine F PRO监测系统包含遵循cGMP规范的监管控制，可作为细胞与基因治疗中的理想候选工具。
iLineF Pro系统具有以下优势和特点：
iLine F Pro系统由三部分组成：1）符合cGMP规范的带有7寸显示屏的分析仪；2）符合 ISO 及FDA 多项规定的连接器BioConnect；3）OsOne专利分析软件。
iLine F Pro系统可监测并提供的关键质量属性（CQAs)有：
细胞活性 (cell viability)
细胞数量 (cell count)
激活状态 (activation-like state)
磁珠数量 (magnetic beads count)
感染动力学 (infection kinetics)
细胞形态变化 (cell morphological changes)
图5 iLine F Pro实时监测关键质量参数
图6 iLine F Pro实时监测细胞种类
图7 iLine F Pro实时监测SF9细胞转染情况
图8 iLine F Pro在CAR-T生产中的应用
应用案例
疫苗开发
背景：病毒表达载体系统 (BEVS)用于感染Sf9细胞，以表达目标重组蛋白。
目的：建立在细胞培养过程中可进行连续监测的在线(In-line)系统。
试验后心得：
1. 优化传统计数法：计数结果与现有方法具有高一致性
2. 整合抛弃式耗材：改善生物反应器的性能
3. 连续监测：实时提供趋势图
4. 作为PAT 工具：提供质量控制的实时关键制程参数
5. 分析特定细胞型态：建立杆状病毒感染Sf9细胞的算法，了解细胞转导的进程
6. 资料再分析：历史数据可套用修正后的算法再次分析，有助于优化系统精确性。
⇑ 与离线计数法呈高度一致性
⇑连续监测细胞直径
⇑ iLine F可使感染进程更加完全
应用案例
背景：现行的细胞治疗制程要达到制程分析技术 (PAT)尚须克服许多瓶颈。
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细胞治疗制程分析技术 (PAT) 重点 |
目前采样与生物反应器处理之程序 |
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1. 通过繁琐步骤才能从生物反应器取得样品 2. 手动制备进行 VCC 分析，并人工记录及确认 3. 依离线分析结果，调整生物反应器馈料速率 4. 非实时监测数据，须人工反复进行离线分析 |
目的：测试iLine F 自动监控T细胞扩增的可行性。
试验后心得：
1. 在线连续监测：用户实时调控细胞培养过程，降低制程与产品变异性
2. PAT 工具：推广封闭式的细胞疗法制程
3. 监测多种细胞属性：增加对制程及产品的了解
4. 降低生产成本：连续监控、减少人力成本、缩短制程
5. 加快研发与定性：良好的PAT工具，使开发更加快速
⇑ iLine F与对照组的VCC结果呈高度一致性
⇑实时监测，及早定义馈料时间点
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