BPT50  50T（50人份，分五个**包装）

端粒酶（Telomerase）是一种酶促核糖**白复合物。其催化亚基（TERT）具有逆转录酶的特性，TERT被认为是端粒酶活性表达的关键组分，其编码的mRNA水平与端粒酶活性一致，与端粒酶的活化程度密切相关。因此，对端粒酶催化亚基的检测可以间接反映样本中端粒酶活性。

本产品试剂KIT采用双色荧光qPCR（TaqMan探针法）检测端粒酶催化亚基TERT基因和内参基因***DH。通过提取细胞RNA，利用特异性逆转录引物进行逆转录反应，以cDNA为模板在单管中利用多重荧光定量PCR进行扩增反应（双重探针：FAM、Cy5）。选用293T细胞为阳性对照以及MRC-5细胞为阴性对照，通过∆∆CT法检测样本中TERT基因的相对表达量。该试剂KIT具有以下特点：

1. 灵敏：双色探针，灵敏度高。

2. 稳定：全程闭管操作，无交叉污染。

3. 可靠：含内参基因，避免假阴性。

4. 方便：操作简单，无需电泳步骤。

5. 定量：以CT值判断，可定量检测。

低温冷冻运输，避光-20℃保存，保质期6个月。开盖后，4℃保存，保质期1周。

注：1.本试剂盒提供试剂，使用前先低速离心、后小心开启。使用时请上下轻柔颠倒十次混匀，避免起泡，并低速短暂离心后使用；

2.为了避免反复冻融，10 人份/管作为一个包装。

1. 逆转录反应

使用Trizol法抽提细胞RNA，RNA纯度A260/280在1.9-2.0之间。取1ug RNA使用Thermo逆转录试剂KIT（货号：K1622），将试

剂KIT中的Random Primer替换成Biowing®Specific Reverse Transcription  Primers进行反转录反应得到cDNA。

1.1 DNase I处理

                 反应程序：37℃ 30min；加EDTA 1 μL 后，65℃，10min

1.2 逆转录反应       

反应程序：20℃ 10min；42℃ 1h；72℃ 5min
 

2. qPCR反应体系及条件

2.1 阳性对照处理

将阳性对照cDNA进行2倍、4倍的梯度稀释，每个梯度建议三重复。

2.2 阴性对照处理

将阴性对照cDNA进行2倍、4倍的梯度稀释，每个梯度建议三重复。

2.3 样本处理

将待测样本cDNA进行2倍稀释作为测试浓度，每个样本做三重复。

  反应体系（以20μL为例）      

PCR仪设置（以ABI 7500为例）      

【基线设置】（以ABI 7500为例）

一般默认起始和终止基线位置为3-15个循环，应根据内参基因和TERT基因实际扩增曲线手动将基线起始循环数调整为指数增长期之前即可。

【阈值设置】（以ABI 7500为例）

内参阈值设定：以阳性对照2倍稀释cDNA定内参基因扩增曲线阈值，内参基因(Cy5)初始浓度的CT值定为16±3；

TERT阈值设定：以阳性对照2倍稀释cDNA定TERT基因扩增曲线阈值，TERT基因(FAM)初始浓度CT值的定为25±3。

图1 左:阳性293T细胞的扩增曲线；右:阴性MRC-5细胞的扩增曲线

   （蓝色为TERT基因曲线,黄绿色为内参基因曲线）

1. 阳性对照2倍稀释后TERT基因Ct值在 25±3，内参基因Ct值在16±3，4倍稀释后TERT基因Ct值在26±3，内参基因Ct值在17±3。

TERT基因和内参基因之间∆CT维持在9±3，保持稳定。

2. 阴性对照经2倍、4倍梯度稀释后，TERT基因Ct值≥35（或检测不到），内参基因Ct值仍在13-20之间，判定为端粒酶活性为阴性。

3. 结果说明

若待测样本内参基因Ct值在13-19之间，TERT基因Ct值＜35且扩增曲线正常，则样本端粒酶活性为阳性。

若待测样本内参基因Ct值在13-19之间，TERT基因Ct值≥35且无明显的扩增曲线则样本无端粒酶活性。

1. 待测样本cDNA 2倍稀释作为模板，三次技术重复，不设置梯度稀释；阳性对照、阴性对照进行2倍、4倍梯度稀释，建议分别做三重复；

避免偶然误差的产生。

2. 如果阳性/阴性对照2倍稀释后内参基因Ct值＞19，表明参考品有降解或者试剂盒扩增效率下降。

3. 如果所有样本2倍稀释后内参基因Ct值＞19，表明试剂盒的扩增效率下降。

4. 如果阳性对照2倍稀释后TERT基因Ct值＞28，表明TERT基因检测系统失效。